MARCH1促进上皮性卵巢癌恶性生物学行为及其机制的研究

发布时间：2020-10-24 14:45

　　 第一部分MARCH1在卵巢恶性肿瘤中表达情况目的:明确MARCH1在卵巢恶性肿瘤中的作用,探索其在卵巢恶性肿瘤组织中的表达情况及其与卵巢恶性肿瘤临床病理特征的关系。方法:通过免疫组织化学染色方法对卵巢恶性肿瘤组织芯片和正常卵巢组织染色,观察并记录MARCH1在组织中的表达情况。分别按照染色强度不同分为0、1、2和3分,按照着色面积大小分为0、1、2和3分,组织染色评分为染色强度分数乘着色面积分数结果从0-9分,0分为阴性,0IHC≤4为弱阳性;5≤IHC≤9为强阳性。通过统计分析其中上皮性卵巢癌(EOC)组织中MARCH1染色结果与EOC临床病理资料的相关性。结果:MARCH1在63例原发性卵巢恶性肿瘤组织中,34例(54.97%)卵巢恶性肿瘤组织强阳性;而在4例正常卵巢组织和10例癌旁正常卵巢组织中,仅有2例(14.29%)强阳性。统计结果发现MARCH1在卵巢癌组织中过表达。由于EOC样本量不足,其MARCH1免疫组化结果与卵巢癌类型、分级或分期暂未发现统计学相关性。结论:MARCH1在卵巢恶性肿瘤中起促癌作用。第二部分MARCH1促进卵巢癌SKOV3细胞恶性生物学行为目的:探索MARCH1对卵巢癌细胞生物学行为的作用。方法:通过siRNA干扰技术敲减卵巢癌SKOV3细胞MARCH1,构建敲减MARCH1(siMARCH1)组细胞和阴性对照(NC)组细胞。采用CCK-8试验和EdU染色检测细胞的增殖能力。分别采用划痕试验和基质胶被覆Transwell试验检测细胞迁移能力和侵袭能力。结果:siRNA敲减MARCH1结果显示细胞MARCH1在基因水平及蛋白水平均明显降低。CCK-8结果显示,在第1、2天,NC组和siMARCH1组细胞吸光值无统计学差别,第3、4、5、6天,siMARCH1组细胞吸光值低于NC组细胞。EdU试验结果显示,MARCH1敲减后,EdU阳性细胞数量较NC组细胞少。划痕实验结果显示:试验第72小时,MARCH1敲减组细胞划痕宽度大于对照组细胞。侵袭实验结果显示:实验48小时后,si MARCH1组穿过小室的细胞数较NC组少。结论:敲减MARCH1后,卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭能力降低。MARCH1促进卵巢癌增殖和转移的恶性生物学行为。第三部分MARCH1调控卵巢癌SKOV3细胞生物学行为的分子机制目的:探索MARCH1调控卵巢癌的分子机制。方法:采用荧光素酶基因报告检测细胞通路活性。采用实时荧光聚合酶链反应法检测细胞中目的基因水平相对表达量。采用蛋白质印迹法检测细胞中目的蛋白相对表达量。采用细胞免疫荧光法检测目的蛋白在细胞中的分布和相对表达量。结果:MARCH1敲减后,卵巢癌细胞中NF-κB通路活性降低,RelA和p50蛋白不仅表达降低,同时其核内分布减少。反之,通过PDTC抑制NF-κB通路后,MARCH1表达量降低。siRNA干扰敲减p50或RelA,MARCH1表达量降低。MARCH1敲减后,卵巢癌细胞中Wnt通路活性降低,其通路关键蛋白β-连环蛋白表达量降低,入核减少;同时,E-钙粘蛋白表达升高。结论:抑制卵巢癌细胞中NF-κB通路可降低MARCH1表达,敲减MARCH1后细胞中NF-κB通路受抑制,因此NF-κB和MARCH1形成相互调控的正反馈回路。另外,敲减MARCH1下调Wnt/β-catenin通路。第四部分卵巢癌SKOV3细胞中MARCH1潜在调控蛋白质组学研究目的:拟通过高通量筛选siMARCH1组对比NC组卵巢癌细胞中表达变化蛋白,为进一步研究MARCH1对卵巢癌细胞作用的分子机制提供基础。方法:通过同位素标记MARCH1敲减组和对照组卵巢癌细胞的蛋白,结合串联质谱分析两组细胞蛋白,筛选siMARCH1组比NC组蛋白的比值小于0.77或大于1.3的蛋白。通过蛋白组学库分析筛选蛋白的功能学分类。通过mRNA验证筛选蛋白mRNA表达水平;采用western blot检测筛选蛋白表达水平。结果:通过iTRAQ结合串联质谱分析结果筛选到卵巢癌细胞MARCH1敲减后上调蛋白67个,下调蛋白48个。筛选出的蛋白在mRNA水平验证结果和蛋白水平验证结果与iTRAQ结果变化水平一致。结论:筛选得到MARCH1敲减后卵巢癌细胞中表达发生变化的蛋白,为进一步研究MARCH1在卵巢癌细胞中作用的分子机制提供基础。
【学位单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R737.31
【部分图文】：

19图 1-1 MARCH1 蛋白在正常卵巢组织及不同卵巢癌组织中免疫组化染色结果。（A）正常卵巢组织（B）浆液性腺癌（C）乳头状浆液性癌（D）液性腺癌（E）子宫内膜样癌（F）透明细胞癌（G）内胚窦癌（H）颗粒细胞癌（I）无性细胞瘤（J）卵泡膜细胞瘤（K）转移性腺癌（L）恶性成熟畸胎瘤。MARCH1 主要表达于卵巢癌组织中实质细胞胞浆及胞膜上。正常卵巢中难以检测到 MARCH1 蛋白表达。Figure 1-1 Expression of MARCH1 in normal/benign ovary, and ovarian cancer tissue samplesby immunohistochemical staining. (A) Normal ovary. (B) Serous adenocarcinoma. (C)Papillary serous adenocarcinoma. (D) Mucinous adenocarcinoma. (E) Endometrioidcarcinoma. (F) Clear-cell carcinoma. (G) Endodermal sinus carcinoma. (H) Granular cellcarcinoma. (I) Dysgerminoma. (J) Theca cell tumors. (K) Metastatic adenocarcinoma. (L)Cancerous mature ovarian teratoma. MARCH1 staining was predominantly located in thecytoplasm and the cytomembrane of ovarian cancer tissues. MARCH1 expression wasundetectable in normal ovarian tissues.

35图 2-1 MARCH1 在不同卵巢癌细胞株中表达情况re 2-1 Expression of MARCH1 in different ovarian cancer cel小 RNA 干扰（siRNA）技术敲减 MARCH1，并与含有C）组比较，观察卵巢癌 SKOV3 细胞中 MARCH1 表显示：在预设计 siRNA 敲减序列中，三个序列均NA 水平的表达。其中，siMARCH1-2 序列在 MARC，平均敲减水平可达 97.25±2.76%（图 2-2）。

SKOV3 细胞中 MARCH1 效率。siMARCH1-2 敲减序率最高。*表示与 NC（阴性对照）组比较，p<0.05。ct of siRNAs on silencing MARCH1 in SKOV3 cell. siMost efficient inhibition. *p<0.05 vs. the NC (negative co证 siRNA 敲减技术对 SKOV3 细胞中 MARCH1n blot检测NC组与siMARCH1组中MARCH1蛋RCH1-2 序列敲减后，细胞中 MARCH1 蛋白表上结果，siRNA 能有效地敲减 SKOV3 细胞中 M达，该技术可用于后续研究中建立实验组和对照
【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 张彩,田志刚;肿瘤免疫逃逸机制的研究进展[J];国外医学(肿瘤学分册);2000年02期

本文编号：2854595