IKCa1相关的miRNA对HeLa细胞增殖、迁移及侵袭作用机制初探

发布时间：2020-11-16 17:59

　　 目的:1.探讨中电导钙激活钾离子通道(IKCa1)对HeLa细胞增殖、迁移及侵袭特性的影响;2.探究IKCa1对miRNA表达谱的影响,筛选出与IKCa1相关的miRNA,并通过生物信息学预测其靶基因,对其靶基因进行功能分析(GO分析),筛选出差异显著的mi RNA,,对其靶基因进行信号通路富集分析,初步探索IKCa1相关miRNA与HeLa细胞增殖、侵袭及转移的相关关系,为进一步探究mi RNA在预防和治疗宫颈癌的靶标分子中提供了线索。方法:1.分别设置浓度为0、10.0、20.0、30.0、40.0μmol/L TRAM-34(IKCa1特异性阻断剂)为观察1-5组及等体积的DMSO组(TRAM-34溶剂)处理HeLa细胞24h、48h和72h,采用CCK8实验检测HeLa细胞增殖特性;采用划痕实验测量HeLa细胞实际迁移距离从而检测HeLa细胞迁移特性;2.按上述6组分组处理HeLa细胞48小时后用Transwell实验检测其侵袭特性;3.通过本研究前期预实验、查阅相关文献、结合CCK8实验及划痕实验结果筛选0.0、30.0μmol/L TRAM-34分别处理HeLa细胞48小时作为对照组和实验组,采用高通量测序方法检测IKCa1阻断前、后miRNA表达谱的变化;4.采用q RT-PCR法对部分差异显著表达miRNAs进行验证,从而验证高通量测序结果的准确性;5.运用mi Randa、miRWalK、Targetscan、DIANAmT、miRDB等软件预测筛选的差异显著表达miRNA可能调控的靶基因以及GO功能分析;再从表达谱中上调和下调的miRNA中各选一个与宫颈癌密切相关的mi RNA作为研究对象即为靶miRNA,对其靶基因进行信号通路富集分析。结果:1.CCK8实验提示TRAM-34抑制HeLa细胞的增殖,在一定范围内,具有剂量依赖性,在培养细胞24h时DMSO组、观察1组和观察2组三组间差异均不具有统计学意义(p0.05),其余各组与DMSO组及与观察1组之间具有显著性差异(p0.001);而培养HeLa细胞48、72h后,DMSO与观察1组间差异不具有统计学意义(p0.05),而其余各观察组与观察1组、DMSO组之间差异均具有统计学意义(p0.001),提示本实验中MDSO浓度对HeLa细胞无影响;划痕实验提示TRAM-34能抑制HeLa细胞迁移,在一定范围内,具有时间及剂量依赖性,随着浓度增加及作用时间延长,抑制迁移作用越明显(p0.001))。2.Transwell侵袭实验证明,在一定浓度范围内,HeLa细胞的侵袭率随TRAM-34浓度增加呈递减趋势(F=384.050,p0.001)。3.分析对照组与实验组的mi RNA高通量测序结果,通过对不同样本的Clear data的比较,分析其共有序列及特有的序列,以Fold Change≧1.5,qvalue0.01为差异显著表达的筛选标准,在871条差异表达中筛选出20个差异显著表达的mi RNAs,其中15个差异miRNA表达上调,5个差异miRNA表达下调。4.结合高通量测序结果及查阅相关文献,在15个表达上调的mi RNA中挑选4个(hsa-miR-451a、hsa-miR-122-5P、hsa-miR-143-3P、hsa-miR-223-3P)和5个表达下调的miRNA中挑选1个(hsa-mi R-421)进行qRT-PCR验证,结果显示hsa-miR-451a、hsa-miR-122-5P、hsa-miR-143-3、hsa-miR-421表达量的变化趋势与高通量测序的结果一致,在实验组与对照组中差异均具有统计学意义(P0.05),从而检测高通量测序结果的准确性;5.通过生物信息学分析发现,差异显著的miRNA的靶基因主要富集蛋白结合,细胞代谢过程、运输过程等条目;其中hsa-miR-143-5P、hsa-mi R-421与多种肿瘤的发生、发展密切相关。通过对hsa-miR-143-5P、hsa-miR-421进一步行信号通路分析发现,hsa-miR-143--5P靶基因主要涉及到肿瘤蛋白多糖、p53信号通路、癌症相关通路及MAPK信号通路等过程,其中在p53信号通路、MAPK信号通路达到显著性富集水平(p0.01);而hsa-mi R-421靶基因主要涉及到肿瘤蛋白多糖、Rap1信号通路和Wnt信号通路等过程,其中在Wnt信号通路达到显著性富集(p0.01)。结论:推测IKCa1可通过影响相关mi RNAs表达,进一步影响其靶基因在p53/MAPK/Wnt信号通路上的调控,从而对HeLa细胞增值、迁移及侵袭产生影响。抑制IKCa1可抑制HeLa细胞增值、迁移和侵袭。
【学位单位】：西南医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R737.33
【部分图文】：

of HeLa cells（ x s）组别Hela 细胞迁移实际距离（μm）24h 48h 72hDMSO 组 170.05±0.74 227.78±5.37 290.80±0.78观察 1 组 173.01±4.04 234.34±4.66 297.15±4.43观察 2 组 128.09± 4.73* 187.16±4.96* 240.34±3.34*观察 3 组 109.95±4.79* 165.90±11.37* 190.95±10.60*观察 4 组 64.60±4.84* 105.48±4.53* 137.01±5.96*观察 5 组 45.66±4.60* 64.10±5.73* 81.93±12.48*注：与 DMSO 组相比，*P<0.001。Note：compared with group DMSO，*P<0.001

表 6 各组 HeLa 细胞总 RNA OD260/280 及 6 Total RNAOD260/280 and concentrationOD260/280 浓度(ng/ul) 1 1.96 187.9 2 1.83 201.7 3 1.87 190.3 1 1.83 303.6 2 1.92 329.3 3 2.01 327.7

西 南 医 科 大 学 硕 士 学 位 论 文法从上调差异显著表达的 miRNAs 中选择 4 个 miRNAs（hsa-miR-451a、sa-miR-122-5P、hsa-miR-143-3P、hsa-miR-223-3P）和下调差异显著表达 miRNAs 中挑选一个（hsa-miR-421）进行验证。实验组与对照组中各测 miRNA 和内参 U6 的溶解曲线及扩增曲线如图 5A、5B 所示；溶解线仅出现一个单一峰，提示引物特异性好；说明所测的 Ct 值可应用后检测。而通过 RT-PCR 结果发现 hsa-miR-451a、hsa-miR-122-5P、sa-miR-143-3、hsa-miR-421 表达量的变化趋势与高通量测序的结果基本致（P＜0.05），进一步证实了高通量测序结果的准确性，见图 6。
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本文编号：2886500