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核糖体蛋白RPL41调节ATF4在卵巢癌中的作用及其机制

发布时间:2020-11-18 05:37
   研究背景及目的:卵巢癌是常见的妇科恶性肿瘤,起病隐匿,死亡率高。严重威胁是女性健康。与正常组织相比较,ATF4在肿瘤组织中的表达高,肿瘤微环境(如缺氧/无氧、氧化应激和内质网应激等)信号可以上调其表达。目前发现,ATF4与肿瘤细胞的生长转移,侵袭和耐药等信号通路有关。ATF4能够与VEGF-A、uPA基因的启动子区域相结合,增强其转录活性来上调二者表达;而目前表明VEGF-A和uPA基因在卵巢癌的生长及转移中发挥着十分重要的作用。核糖体蛋白RPL41(Ribosomal protein L41,RPL41),由25个氨基酸组成小分子多肽。目前研究表明rpl41表达的下调与多种肿瘤细胞有关。课题组前期研究表明RPL41能够诱导ATF4磷酸化,转移到蛋白酶体内迅速降解。而RPL41分子量小,可以自由穿过细胞膜,具有成为药物的先天优势。在本次研究中,我们使用小分子胎RPL41诱导ATF4表达下调,探讨RPL41对于卵巢癌细胞的抑制作用及其机制,在为卵巢癌的治疗提供新的靶点。研究方法:1.RPL41对OC细胞系A2780及CAOV3细胞的抑制作用,并观察RPL41引起卵巢癌细胞凋亡的形态学改变以及对OC细胞周期的影响(1)利用CellTiter-Glo?荧光细胞活性检测系统观察RPL41对细胞的作用。(2)采用Hoechst荧光染色法观察A2780及CAOV3细胞凋亡的形态学变化。(3)利用流式细胞仪测定不同浓度RPL41干预后,A2780细胞、CAOV3细胞细胞周期与凋亡情况2.细胞划痕试验和Transwell侵袭小室实验研究RPL41对A2780及CAOV3细胞的迁移及侵袭能力的影响。(1).细胞划痕试验观察RPL41对A2780细胞、CAOV3细胞迁移能力的影响(2)侵袭小室实验观察RPL41对A2780细胞、CAOV3细胞侵袭能力的影响3.研究RPL41抑制细胞生长、侵袭及转移的分子机制。(1).双荧光素酶报告基因检测系统研究卵巢癌细胞中ATF4对VEGF-A和uPA启动子的调控作用。(2).应用Western blot及RT-PCR技术验证RPL41诱导的ATF4降解是否能够下调VEGF-A及uPA基因的表达。结果:Hoechst荧光染色及Annexin-V/Pl双染检测A2780细胞、CAOV3细胞凋亡结果显示:不同浓度RPL41作用24h后,随着RPL41作用浓度的增加,细胞凋亡率增加,细胞形态出现改变,在RPL41浓度大于100μM时,差异有统计学差异(p0.05)。而作用48h后,细胞凋亡趋势并不明显,无统计学差异。CellTiter-Glo?实验结果表明,细胞活性随着RPL41作用浓度的增加,作用时间的延长而降低。划痕实验及侵袭小室实验研究结果表明RPL41可以有效抑制卵巢癌细胞A2780、CAOV3的迁移和侵袭能力,差异具有统计学意义(p0.01)。双荧光素酶报告基因测试系统,研究结果显示ATF4对VEGF-A和uPA启动子具有调控作用,而Western blot及RT-PCR结果显示:ATF4,VEGF-A和uPA随着RPL41浓度的增高,表达降低。结论:1.RPL41诱导OC细胞产生形态学变化,抑制其生长,促进细胞凋亡,并且作用于G2-M期。2.RPL41抑制A2780及CAOV3细胞的迁移及侵袭能力3.RPL41诱导ATF4下调,进而对VEGF-A及uPA启动子进行调控4.RPL41可以作为敲低ATF4的媒介
【学位单位】:中国医科大学
【学位级别】:硕士
【学位年份】:2018
【中图分类】:R737.31
【部分图文】:

细胞形态学,依赖性


图 1. Hoechst 检测 CAOV3 及 A2780 细胞形态学变化A: 24h 时,A2780 细胞随着 RPL41 浓度的升高而出现细胞核碎裂,浓度越高明显,存在计量依赖性。而 48 小时也出现和碎裂现象,但无明显计量依赖性CAOV3 细胞随着 RPL41 浓度的升高而出现细胞核碎裂,浓度越高,细胞凋亡计量依赖性。而 48 小时也出现和碎裂现象,但无明显计量依赖性。

细胞凋亡,流式细胞技术,双荧光,周期


中国医科大学硕士学位论文.3 Annexin V /PI 双荧光染色检测细胞凋亡与周期结果本实验采用 Annexin V /PI 双荧光染色的法来检测卵巢癌细胞的凋亡情况结果显示: 在 RPL41 浓度分别为 0,20,40,60,80,100μM 时,在作用时的凋亡率分别为:8.5,8.15,17.2,17.42,20.61and 22.03%。而在 RPL41 8 小时的凋亡率确是:6.5,6.6,7.88,9.74,10.14 and 12.38%。实验结果表 24 小时的时候,随着 RPL41 浓度的增加,细胞的凋亡率是随之增加的,且大于 100 μM 时具有统计学意义(p<0.05), 在 48 小时的时候,细胞的凋亡率4 小时反而降低,且组间未见明显差异,无统计学意义 (图.3)

迁移能力,细胞侵袭,细胞的,细胞迁移


中国医科大学硕士学位论文4.5 Transwell 侵袭实验检测 RPL41 对 CAOV3 及 A2780 细胞侵袭能力的抑制能力。实验结对照组细胞侵袭能力较强,而 RPL41 作用组,细胞侵袭能力相对较弱。且具有统计学意义(P<0.01),这表明 RPL41 对卵巢癌细胞 CAOV3 及 A2780力具有抑制作用(如图:5)。
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本文编号:2888373

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