小鼠超数排卵后胚胎质量评价

发布时间：2017-04-07 06:57

  本文关键词：小鼠超数排卵后胚胎质量评价，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:以小鼠为实验对象,探讨小鼠通过不同激素剂量超排处理及不同间隔时间重复超排处理后其胚胎质量是否受到影响,以及septin2蛋白是否影响胚胎质量的初步研究。方法:实验一:1.选取8周龄小鼠120只,随机分成4组,依次为自然发情组(0IU)、5IU组、7.5IU组、10IU组,每组30只,自然发情组不注射激素,其它各组分别注射PMSG(5IU/只)+h CG(5IU/只)、PMSG(7.5IU/只)+h CG(7.5IU/只)、PMSG(10IU/只)+h CG(10IU/只)。2.小鼠超排后与雄性小鼠合笼,次日晨将见栓的雌鼠处死取胚,捡取1-细胞期胚胎并计数,同时通过镜检计数胚胎畸形率。将发育正常的1-细胞期胚胎置37℃,5%CO2的培养箱中培养到囊胚,计数2-细胞胚胎数、4-细胞胚胎数、8-细胞胚胎数、桑葚胚数及囊胚数,并计算各时期胚胎百分率。3.收集培养液,采用ELISA试剂盒检测培养液中IGF-II含量。4.将囊胚用H33258染色后,共聚焦显微镜观察实验二:选取8周龄小鼠40只,随机分成4组,依次为0组(超排后与雄性小鼠合笼,第二天晨将见栓小鼠取胚),1组(于第一次超排处理后间隔5天,即1个性周期后,再次诱导超排),2组(于第一次超排后间隔2个性周期,即10天后再次诱导超排),3组(于第一次超排后间隔3个性周期,即15天后再次诱导超排),每组10只。每次超排注射PMSG(7.5IU/只)+h CG(7.5IU/只)。其余步骤同实验一。实验三:1.选取8周龄雌性小鼠30只,采用注射PMSG(7.5IU/只)+h CG(7.5IU/只)方法诱导超排,与10周龄雄性小鼠合笼见栓后,解剖后取1-细胞期胚胎,挑选出形态正常的胚胎400个,分成实验1组和对照1组两组,每组200个。实验1组培养在FCF培养液中,对照1组培养在DMSO培养液中,37℃,5%CO2培养至囊胚,统计囊胚个数,并将囊胚进行α-tubulin免疫荧光染色。2.除400个以外的胚胎,也平均分成实验2组与对照2组,分别培养在上述两种培养液中,至所需阶段,用于septin2蛋白免疫荧光染色。结果:实验一1.与自然发情组相比,5IU组、7.5IU组、10IU组1-细胞期胚胎显著增多(P0.01),7.5IU组平均胚胎数最多,并显著多于5IU组(P0.05);畸形率10IU组最高,显著高于0IU组及5IU组(P0.05);2-细胞胚胎发育率都在95%以上,4-细胞胎胚胎发育率都下降到90%以下,各组间差异不显著;8细胞胚胎发育率10IU组最低,显著低于5IU组(P0.05);桑葚胚发育率,与5IU组相比,7.5IU组及10IU组显著减少(P0.05);囊胚发育率依次为0IU5IU7.5IU10IU,10IU组显著低于其它各组(P0.05)。2.ELISA实验结果表明,各组培养液中IGF-II含量依次为0IU5IU7.5IU10IU,10IU组显著低于其它各组(P0.05)。3.H33258染色后发现,10IU组卵裂球个数稍有减少。实验二1.重复超排间隔时间越短,胚胎畸形率越高,间隔一个性周期组畸形率显著高于间隔三个性周期组和一次超排组,而可用胚胎数越少,随着间隔时间的延长,畸形率变小,可用胚胎数增加,当间隔三个性周期时,基本恢复到一次超排水平。各组间2-细胞胚胎率、4-细胞胚胎率、8-细胞胚胎率以及桑葚胚率无显著性差异,但是具有随着间隔时间延长,各阶段胚胎卵裂率增高的趋势,到间隔三个性周期后,基本恢复到一次超排水平,而对囊胚率来说,间隔一个性周期显著低于一次超排和间隔3个性周期组(P0.05)。2.ELISA实验结果表明,各组培养液中IGF-II含量依次为0组3组2组1组,含量显著低于0组和3组(P0.05)。3..H33258染色后发现,1组和2组卵裂球个数有所减少。实验三1.FCF处理后胚胎囊胚率显著下降(P0.05);2.共聚焦显微镜可以清楚地观察到septin2在对照2组各阶段胚胎主要表达在2-细胞期及以后的各期胚胎卵裂球中,且集中在卵裂球的核上,荧光信号强;在实验2组2-细胞期卵裂球的核上,及4-细胞期、8-细胞期胚胎中颗粒化的卵裂球中也有微弱表达,到桑葚胚以后几乎无表达,且4-细胞、8-细胞胚胎有颗粒化现象。3.与对照组相比,实验组囊胚微管排列不规则,纺锤体形态异常,染色体排列紊乱上。结论:实验一1.PMSG/HCG可以增加小鼠可用胚胎个数;2.PMSG/HCG对小鼠超排具有一定的阈值,剂量过高及过低都不能达到理想效果;3.高剂量PMSG/HCG可影响胚胎质量,降低胚胎发育率;实验二1.重复超排间隔时间越短,对超排效果及胚胎质量越不利;2.重复超排间隔时间越短,发生卵巢囊肿的概率会有所增加;3.重复超排间隔时间达三个性周期以上时,可基本恢复到一次超排水平。实验三1.Septin2蛋白在小鼠早期胚胎2-细胞期到囊胚各时期均有表达,定位于卵裂球的核上;2.FCF抑制剂Septin2蛋白表达可降低;3.敲低Septin2蛋白表达,可致胚胎发育异常,胞质分裂不均,卵裂球大小不一,且数量减少,染色体排列杂乱,以及导致胚胎“颗粒现象”产生;4.敲低Septin2蛋白表达,可致囊胚中微管分布紊乱,卵裂球数目减少,纺锤体形变及染色体排列异常。
【关键词】：超数排卵 重复超排 胚胎质量 septin2
【学位授予单位】：河北大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R714.8
【目录】：

• 摘要4-7
• Abstract7-14
• 第1章 综述14-30
• 参考文献24-30
• 第2章 实验研究30-56
• 实验一 激素剂量对小鼠胚胎质量的影响30-40
• 1 材料与方法30-31
• 2 实验方案31-32
• 3 结果32-37
• 4 讨论37-38
• 5 结论38-40
• 实验二 重复超排间隔时间对小鼠胚胎质量的影响40-47
• 1 材料与方法40
• 2 实验方案40-41
• 3 结果41-45
• 4 讨论45-46
• 5 结论46-47
• 实验三 敲低Septin2蛋白对胚胎质量影响的初步探究47-56
• 1 材料与方法47
• 2 实验方案47-49
• 3 结果49-54
• 4 讨论54
• 5 结论54-56
• 参考文献56-58
• 致谢58-59
• 攻读硕士期间取得的学术成果59

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