miR-291a/b-5p在小鼠着床前胚胎发育的表达变化及作用研究

发布时间：2020-12-30 14:29

　　目的哺乳动物着床前胚胎发育、分化及胚胎基因组激活的调控机制是生殖医学研究领域的难点和热点问题之一。研究着床前胚胎基因表达调控机制,对于深入认识着床前胚胎发育过程,提高人类辅助生殖助孕技术的成功率,揭示不孕与不育、出生缺陷及某些遗传性疾病的发病机理有重要意义。由于小鼠基因组和人类基因组具有广泛的同源性;同时,小鼠胚胎和人类胚胎具有许多共同的特征。因此,对于小鼠胚胎发育的研究,可以帮助人们深入认识人类胚胎发育的过程。近年研究发现,mir-290簇在小鼠着床前胚胎中特异性高表达,但其对小鼠着床前胚胎发育的具体作用和调控机理仍未阐明。近期数据显示,microRNA可通过靶向自噬相关基因参与调控细胞自噬水平,介导细胞应对饥饿、生长因子缺失、内质网应激和病原体感染等应激环境。自噬是细胞分解代谢的重要生理过程。在胚胎发育过程中,自噬在卵母细胞向受精卵转化过程中发挥了降解母源性物质、提供氨基酸能量和维持细胞内稳态的重要作用。有学者在对小鼠黑色素瘤细胞的研究中,发现mir-290簇可靶向作用于自噬相关基因Atg7和ULK1,抑制肿瘤细胞的自噬性死亡。但是,在小鼠着床前胚胎发育过程中,mir-290簇是否... 

【文章来源】：中国人民解放军空军军医大学陕西省 211工程院校

【文章页数】：95 页

【学位级别】：博士

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前言
文献回顾
第一部分 miR-291a/b-5p在小鼠着床前胚胎发育的表达及Atg5和Becn1在着床前胚胎中的动态变化
    1 材料
    2 方法
        2.1 特殊试剂配制与移卵针制备
        2.2 小鼠MⅡ期卵母细胞与着床前胚胎的采集
        2.3 Real Time PCR
        2.4 小鼠MⅡ期卵母细胞与着床前胚胎的免疫荧光检测
        2.5 小鼠着床前胚胎透射电镜标本的制备与检测
        2.6 统计学分析与图形分析
    3 结果
        3.1 miR-291a/b-5p在小鼠MⅡ期卵母细胞和着床前胚胎中的表达
        3.2 Atg5和Becn1在小鼠MⅡ期卵母细胞和着床前胚胎中的表达
        3.3 在小鼠MⅡ期卵母细胞和着床前胚胎中，miR-291a/b-5p与自噬相关基因Atg5和Becn1动态表达的对应关系
        3.4 免疫荧光检测小鼠MⅡ期卵母细胞和着床前胚胎中自噬的动态变化
        3.5 透射电镜检测小鼠MⅡ期卵母细胞和受精卵中自噬的变化
    4 讨论
第二部分 miR-291a/b-5p通过靶向Atg5和Becn1抑制NIH/3T3细胞自噬体形成
    1 材料
    2 方法
        2.1 双荧光素酶报告基因载体构建
        2.2 细胞培养与转染
        2.3 双荧光素酶活性检测
        2.4 Real Time PCR检测
        2.5 Western blot检测
        2.6 统计学分析与图形分析
    3 结果
        3.1 miR-291a/b-5p靶向Atg5和Becn1序列的生物信息学分析结果
        3.2 双荧光素酶报告基因载体测序结果
        3.3 Luciferase Assay检测miR-291a/b-5p对Atg5和Becn1的靶向作用
        3.4 过表达miR-291a/b-5p对Atg5和Becn1 mRNA表达的影响
        3.5 过表达miR-291a/b-5p对雷帕霉素诱导自噬后NIH/3T3细胞中Atg5和Becn1蛋白表达的影响
        3.6 过表达miR-291a/b-5p对雷帕霉素诱导自噬后NIH/3T3细胞自噬体形成的影响
    4 讨论
第三部分 抑制miR-291a-5p对小鼠着床前胚胎Atg5和Becn1表达及早期胚胎发育的影响
    1 材料
    2 方法
        2.1 特殊试剂配制
        2.2 小鼠 1-cell期胚胎的获取和采集
        2.3 小鼠 1-cell期胚胎的胞浆显微注射和体外培养
        2.4 Real Time PCR
        2.5 统计学分析
    3 结果
        3.1 胞浆显微注射后miR-291a-5p inhibitor在小鼠着床前胚胎中的表达
        3.2 胞浆显微注射miR-291a-5p inhibitor对miR-291a-5p的抑制效应及其对Atg5和Becn1mRNA表达的影响
        3.3 胞浆显微注射miR-291a-5p inhibitor对小鼠着床前胚胎发育的影响
    4 讨论
小结
参考文献
个人简历和研究成果
致谢



本文编号：2947802