OPTN基因表达对卵巢癌和宫颈癌细胞耐药性的影响

发布时间：2021-01-16 10:55

　　目的:通过构建敲减、敲除、过表达OPTN基因的SKOV3和Hela细胞系,研究OPTN基因表达影响SKOV3和Hela细胞对抗癌药物DDP的敏感性。方法:针对人OPTN基因序列设计sh RNA（敲减）、sg RNA（敲除）、LV-OPTN（过表达）的序列,构建慢病毒表达载体,转染293T细胞获得慢病毒上清,并感染SKOV3、Hela细胞,经过筛选获得稳定的敲低、敲除、过表达的SKOV3、Hela细胞系。PCR检测敲除OPTN基因,RT-PCR检测敲减、过表达前后OPTN基因表达量的变化;Western blot检测敲低、敲除、过表达OPTN基因的SKOV3和Hela细胞OPTN蛋白表达的变化;MTT法检测DDP对敲低、敲除、过表达OPTN的SKOV3、Hela细胞增殖的影响;流式细胞仪检测OPTN的表达对SKOV3、Hela细胞凋亡的影响;q RT-PCR和Western blot检测凋亡相关基因caspase3、Bax、Bcl-2、PI3K、AKT、m TOR、MDR1、ERCC1、BRCA1的基因表达量（m RNA和蛋白质）的变化,探讨其对PI3K-AKT-m TOR信号通路、凋亡... 

【文章来源】：安徽医科大学安徽省

【文章页数】：65 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

质粒的酶切Fig1.Plasmiddigestion

安徽医科大学硕士学位论文22获得过表达重组质粒PEGFP-NI后，由于插入的为OPTN的编码区的mRNA片段大小为1743bp因此可以利用双酶切的方法进行鉴别，经NheI和XhoI酶切后出现4.7kb和1743bp两个片段，则证明过表达重组质粒构建成功,见图2A。获得敲除重组质粒PX459后，在目的基因片段序列上设计PCR引物，成功重组的质粒可以扩出大小约为500bp的片段，未成功构建的质粒则扩不出片段,见图2B。获得敲减重组质粒PLVX后，由于在质粒PLVX两个酶切位点EcoRI和BamHI之间只有11bp,而插入的目的片段为60bp左右，因此设计了跨酶切位点的PCR引物，成功重组的质粒大小约为220bp,而空载质粒则出现170bp大小的片段，说明PLVX-OPTN构建成功，见图2C。图2重组质粒的初步鉴定Fig2.PreliminaryidentificationofrecombinantplasmidsA:过表达质粒双酶切验证（1：过表达）；B：敲除质粒PCR验证（1、3：对照；2、4：敲除）；C:敲减质粒PCR验证(1：敲减；2：对照)；M:Marker3.1.3重组质粒的测序验证将初步鉴定成功的重组质粒送至上海生工生物有限公司进行基因测序，从图谱结果看出，片段插入的位置正确，和实验设计的碱基序列相同，说明重组质粒构建成功，重组质粒的图谱见图3。

重组质粒测序图谱

【参考文献】：
期刊论文
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本文编号：2980700