从p62影响RIP1泛素化的角度探讨人卵巢癌耐药的机制

发布时间：2017-04-11 22:12

  本文关键词：从p62影响RIP1泛素化的角度探讨人卵巢癌耐药的机制，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景： 卵巢癌细胞耐药是卵巢癌治疗的关键问题，研究组前期工作发现，在卵巢癌顺铂耐药细胞中p62高表达，可以诱导自噬，自噬通过缓解内质网应激降低了对顺铂的敏感性，从而导致卵巢癌细胞对顺铂耐药。可见肿瘤细胞的存活与死亡之间的失衡是导致肿瘤细胞耐药的主要原因。 有研究表明，NF-κB能够促进肿瘤细胞的生存，p62能够通过与TRAF6结合参与这个过程。此外p62在结构上存在泛素相关结构域，从而能够与K48-多聚泛素链和K63-多聚泛素链相结合，因此p62不仅可以通过自噬途径帮助泛素化蛋白降解，也能够通过与多聚泛素化链相结合，与其他开关蛋白相互作用，发挥促存活或者促凋亡的双重作用。已有研究证实，p62与开关蛋白RIP1有相互作用位点。RIP1不仅能够活化NF-κB促进细胞的生存，也能够活化caspase-8，发挥调节细胞凋亡的作用。 目的： 本实验从p62影响RIP1的泛素化、进而参与NF-κB信号途径活化的角度，，深入探讨人卵巢癌细胞耐药的机制。 方法： 以人卵巢癌细胞株即SKOV-3细胞及其子代人卵巢癌顺铂耐药细胞株即SKOV-3/DDP细胞为研究对象，顺铂作用于两种细胞，通过小干扰RNA抑制p62蛋白表达。利用MTT法检测两种细胞存活率；利用倒置光学显微镜及全自动显微镜数码系统，观察并拍摄两种细胞形态学方面变化；采用蛋白质印记（Western Blot）法，提取两种细胞总蛋白检测RIP1、p62蛋白表达变化，提取核蛋白检测NF-κB（p50）、NF-κB（p65）、磷酸化IκBα（p-IκBα）和IκBα蛋白表达，定量p-IκBα/IκBα蛋白比值，分析NF-κB活化情况；通过免疫荧光法，观察细胞中NF-κB（p65）的入核情况；通过免疫共沉淀法，检测细胞中RIP1的泛素化形式的变化。 结果： 1）与SKOV-3细胞比较， SKOV-3/DDP存活率较高，在顺铂作用24h后，部分细胞变圆显漂浮状态；而SKOV-3细胞几乎全部死亡。表明SKOV-3/DDP细胞较SKOV-3细胞对顺铂有更强的抵抗性。 2）与SKOV-3细胞比较，p62蛋白在SKOV-3/DDP细胞中高表达，顺铂作用下，p62蛋白表达水平降低；RIP1蛋白在SKOV-3/DDP细胞中高表达，顺铂作用下，其变化不明显。 3）与SKOV-3细胞比较，顺铂作用12h和24h，SKOV-3/DDP细胞核蛋白NF-κB(p50)和(p65)表达增加，p-IκBα蛋白表达增加，p-IκBα/IκBα蛋白比值增加，NF-κB(p65)蛋白在细胞核内免疫荧光增加。 4）与SKOV-3细胞比较，顺铂作用下，SKOV-3/DDP细胞RIP1的K63泛素化表达高，RIP1的K48泛素化降低，均存在时间依赖性。 5）抑制p62蛋白表达，SKOV-3/DDP细胞中的RIP1K63泛素化显著降低，RIP1K48泛素化显著增加，NF-κB活化程度和细胞存活率也降低。 结论： （1）在SKOV-3细胞和SKOV-3/DDP细胞中p62、RIP1蛋白表达存在差异，表明p62、RIP1可能与顺铂耐药有关。 （2）顺铂作用下，SKOV-3/DDP细胞中RIP1的泛素化形式是决定NF-κB信号通路活性的原因之一。 （3）人卵巢癌顺铂耐药细胞中，p62可能通过调控RIP1的泛素化形式，参与活化NF-κB信号途径,促进了肿瘤细胞耐药的形成。
【关键词】：p62 RIP1 NF-κB 泛素化 耐药
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.31
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-9
• 主要英文缩略索引9-14
• 第1章 文献综述14-21
• 1.1 顺铂治疗人卵巢癌细胞的研究进展14-15
• 1.1.1 人卵巢癌发病特点14
• 1.1.2 顺铂的结构和药理学特点14
• 1.1.3 卵巢癌化疗耐药14-15
• 1.2 支架蛋白 p62 的结构与功能15-16
• 1.2.1 p62 的结构域15
• 1.2.2 p62 与 NF-κB 信号通路调控15-16
• 1.3 RIP 激酶的研究进展16-18
• 1.3.1 RIP 家族介绍16-17
• 1.3.2 RIP1 的结构与功能17-18
• 1.4 泛素与泛素化的研究进展18-19
• 1.4.1 泛素18
• 1.4.2 泛素化18-19
• 1.5 核因子（NF-κB）信号通路与 p6219-21
• 1.5.1 NF-κB 信号通路19
• 1.5.2 NF-κB 的信号调节因素19-21
• 第2章 实验部分21-45
• 2.1 引言21-22
• 2.2 实验材料22-24
• 2.2.1 实验仪器22-23
• 2.2.2 实验试剂23-24
• 2.3 实验方法24-33
• 2.3.1 卵巢癌细胞及卵巢癌耐药细胞的培养24-25
• 2.3.2 MTT 实验检测人卵巢癌及人卵巢癌顺铂耐药细胞的存活率25-26
• 2.3.3 全自动显微镜数码系统观察并拍摄卵巢癌及卵巢癌耐药细胞的形态及存活情况26
• 2.3.4 Western Blot 实验定量分析蛋白质变化26-28
• 2.3.5 提取细胞核蛋白28
• 2.3.6 免疫荧光实验定性分析核因子的变化28-30
• 2.3.7 免疫共沉淀实验分析蛋白质之间的相互作用30-31
• 2.3.8 小干扰 RNA 方法抑制 p62 蛋白的表达31-32
• 2.3.9 统计分析32-33
• 2.4 实验结果33-45
• 2.4.1 顺铂对 SKOV-3 细胞和 SKOV-3/DDP 细胞存活率和形态的影响33-35
• 2.4.1.1 MTT 实验方法检测顺铂作用下 SKOV-3 及 SKOV-3/DDP 的存活率33-34
• 2.4.1.2 顺铂作用下 SKOV-3 细胞及 SKOV-3/DDP 细胞形态学变化34-35
• 2.4.2 顺铂作用下 SKOV-3 细胞及 SKOV-3/DDP 细胞 p62、RIP1 蛋白表达变化35-36
• 2.4.3 顺铂作用下 SKOV-3 细胞和 SKOV-3/DDP 细胞中 NF-κB 信号通路表达的变化36-39
• 2.4.3.1 顺铂作用下 SKOV-3 细胞和 SKOV-3/DDP 细胞中 NF-κB 亚单位p50、p65 蛋白表达变化36-37
• 2.4.3.2 顺铂作用下 SKOV-3 细胞和 SKOV-3/DDP 细胞中 IκBα及 p-IκBα蛋白表达变化37-38
• 2.4.3.3 顺铂作用下 SKOV-3 细胞和 SKOV-3/DDP 细胞中 NF-κB 亚单位 p65蛋白亚细胞表达变化38-39
• 2.4.4 顺铂作用下 SKOV-3 细胞和 SKOV-3/DDP 细胞 RIP1 泛素化形式的改变39-41
• 2.4.5 构建 p62 siRNA 表达载体转染入 SKOV-3/DDP 细胞41-42
• 2.4.6 抑制 p62 的表达对顺铂作用下 SKOV-3/DDP 细胞中 RIP1 泛素化的影响42-43
• 2.4.7 抑制 p62 表达对顺铂作用下 SKOV-3/DDP 细胞 NF-κB 信号通路活性的影响43-44
• 2.4.8 抑制 p62 表达对顺铂作用下 SKOV-3/DDP 细胞存活率的影响44-45
• 第3章 讨论45-48
• 第4章 结论48-49
• 参考文献49-56
• 作者简介及在学期间所取得的科研成果56-58
• 致谢58

【共引文献】

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本文编号：300099