孤儿核受体Nur77转录调节HOXA10表达促进胚胎黏附研究

发布时间：2021-02-19 17:42

　　目的 HOXA10是胚胎黏附的重要调控分子,其表达降低将导致胚胎种植失败,已知反复种植失败患者子宫内膜组织中Nur77和HOXA10的表达均降低。本研究旨在探究Nur77是否通过转录调节HOXA10表达参与胚胎黏附的调控。方法 1、通过荧光素酶双报告基因、染色质免疫共沉淀以及链亲和素-生物素偶联DNA沉淀反应实验明确Nur77转录调控HOXA10的机制;2、采用腺病毒Ad-Flag-Nur77和Ad-siNur77介导Nur77的过表达和抑制表达,并通过Western Blot实验检测Nur77对人子宫内膜癌细胞系Ishikawa细胞中HOXA10表达的影响;3、利用Nur77激动剂6-MP和JAR球黏附实验（人胎盘绒毛癌细胞JAR细胞球黏附于Ishikawa细胞）明确HOXA10介导Nur77对胚胎黏附的作用。结果 荧光素酶双报告基因、染色质免疫共沉淀和链亲和素-生物素偶联DNA沉淀反应实验结果证实Nur77直接结合于HOXA10启动子区的NBRE反应元件AAAGGTCA（-3075/-3067）,并促进 Ishikawa 细胞中 HOXA10 的转录。腺病毒Ad-Flag-Nur7... 

【文章来源】：南京大学江苏省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：60 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图１：?Ｎｕｒ７７促进丨ｓｈｉｋａｗａ细?

我们分别构建了含有ＮＢＲＥ位点的启动子区片断报告基因质粒??（ＨＯＸＡＩＯ－Ｌｕｃ）和ＮＢＲＥ位点缺失突变的启动子报告基因质粒（ＨＯＸＡｌＯ－ｄｅｌ－??Ｌｕｃ）（图２Ａ）。荧光素酶报告基因实验结果显示，外源性给予Ｎｕｒ７７腺病毒可上??调ＨＯＸＡ１０启动子活性达２倍以上（图２Ｂ），但对ＨＯＸＡｌＯ－ｄｅｌ－Ｌｕｃ片段的启??动子活性无影响（图２Ｃ）

??为了进一步鉴定ＨＯＸＡＩＯ是否为Ｎｕｒ７７作用的靶基因，我们进行染色质免??疫共沉淀实验（ＣｈＩＰ－ＰＣＲ）。如图３Ａ所示，利用针对ＨＯＸＡＩＯ预测结合位点序??列的引物ＰＣＲ扩增，可以从感染Ａｄ－Ｆｌａｇ－Ｎｕｒ７７腺病毒的细胞免疫沉淀复合物??中，扩增出预期大小的ＤＮＡ片段，而对照组不能扩增出目的条带。这表明Ｎｕｒ７７??与ＨＯＸＡＩＯ启动子区直接结合。??如图３Ｂ所示，我们合成含ＡＡＡＧＧＴＣＡ的ＨＯＸＡＩＯ启动子的双链寡核苷??酸，且将ＡＡＡＧＧＴＣＡ突变为ＡＧＡＡＴＴＣＡ的对应片段，用生物素标记。收集感??染Ａｄ－Ｆｌａｇ－Ｎｕｒ７７?（ｍｏｉ＝１００）的Ｉｓｈｉｋａｗａ细胞总蛋白，与标记／未标记生物素的??双链寡核苷酸进行链亲和素免疫沉淀，结果显示Ｎｕｒ７７与野生型（ＷＴ）片段相??１７??

【参考文献】：
期刊论文
[1]Regulatory Effect of Estrogen, Progestin and HB-EGF on the Expression of HOXA10 Gene in Ishikawa Cells[J]. 刘雪梅,朱桂金,钟刚.  Journal of Huazhong University of Science and Technology（Medical Sciences）. 2007(04)



本文编号：3041463