在宫颈癌细胞中microRNA-429下调IKKβ的表达发挥抑癌基因的作用

发布时间：2017-04-13 18:09

  本文关键词：在宫颈癌细胞中microRNA-429下调IKKβ的表达发挥抑癌基因的作用，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:宫颈癌是世界上常见的恶性肿瘤之一,在女性恶性肿瘤中排名第四位,而且在年轻女性中有发病率增加的趋势。已有大量研究表明,宫颈癌的发生与HPV感染相关,但随着对宫颈癌研究的深入,人们发现microRNAs(miRNAs)也能够参与宫颈癌的发生发展过程中。miRNAs是长度大约为22nt的单链非编码RNA,能够通过与mRNA3’UTR的结合来抑制其翻译或降解其mRNA,达到调节体内靶基因表达的目的,通过上述过程,miRNA参与调节与肿瘤发生相关的增殖、迁徙、转移和凋亡等多个过程。已有文献报道,宫颈癌的发生伴随着多种miRNAs表达谱的异常改变,暗示着miRNAs可能与宫颈癌的发生相关。已发现miR-429在许多肿瘤中表达下调,并具有抑制肿瘤增殖和诱导凋亡的作用,但在宫颈癌中的作用还不清楚。因此本研究旨在探讨miR-429在宫颈癌中细胞中的作用,及其发挥作用的分子学机制,为更好的研究宫颈癌发生的分子学机制提供新的基础。方法:首先我们通过RT-qPCR实验检测了15对宫颈癌组织中miR-429的表达水平,然后通过MTT实验、集落实验和凋亡实验检测了miR-429对宫颈癌细胞系HeLa和C33A细胞增殖和凋亡的影响。接下来我们利用生物信息学方法,通过miRBase Targets、TargetScan和PicTar等靶基因预测软件,筛选出IKKβ作为miR-429的靶基因,随后我们构建了包含IKKβ3’UTR的野生型和突变型序列的EGFP报告载体,然后通过荧光报告载体实验证实miR-429靶定IKKβ并下调其表达,接下来,我们还通过Real-time PCR和western blotting实验分别从mRNA水平和蛋白水平证实了二者的靶定关系,另外,还通过RT-qPCR实验检测了15对宫颈癌组织中IKKβ的表达水平,并对宫颈癌组织中miR-429和IKKβ进行了相关性分析。为了深入研究miR-429和IKKβ的关系和靶基因IKKβ的功能,构建了IKKβ过表达和敲降质粒,并且通过MTT实验、集落实验和凋亡实验证实IKKβ具有促进宫颈癌细胞He La和C33A增殖和抑制细胞凋亡的功能。最后,通过挽救实验来证实miR-429对宫颈癌细胞增殖和诱导凋亡的影响是由IKKβ介导实现的。结果:与癌旁正常组织相比,在宫颈癌组织中miR-429表达下调。过表达miR-429能够抑制宫颈癌细胞HeLa和C33A的增殖能力并诱导其凋亡。利用miRBase Targets、TargetScan和Pic Tar等生物信息学软件预测IKKβ的3’UTR区域存在miR-429的结合位点。通过荧光报告载体实验证实miR-429直接靶定IKKβ并下调其表达,Real-time PCR和western blotting实验也分别从mRNA水平和蛋白水平证实了二者的靶定关系。在宫颈癌组织中IKKβ表达上调且与miR-429呈负相关关系。在宫颈癌细胞HeLa和C33A中,IKKβ发挥促进细胞增殖和抑制凋亡的作用。挽救实验证实IKKβ介导了miR-429对宫颈癌细胞的增殖能力和凋亡的影响。结论:本篇文章首次发现在宫颈癌细胞系HeLa和C33A中miR-429通过靶定并下调其靶基因IKKβ的表达来发挥抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡的作用,为深入研究宫颈癌发生的分子学机制提供了新的基础。
【关键词】：miR-429 宫颈癌 IKKβ 增殖 凋亡
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.33
【目录】：

• 中文摘要4-6
• ABSTRACT6-11
• 缩略语11-13
• 前言13-17
• 研究现状、成果13-16
• 研究目的、方法16-17
• 一、MIR-429在宫颈癌细胞中的作用研究17-32
• 1.1 材料和方法17-28
• 1.1.1 实验材料17-18
• 1.1.2 实验方法18-28
• 1.1.3 统计学方法28
• 1.2 结果28-31
• 1.2.1 RT-qPCR检测miR-429在宫颈癌组织中与癌旁正常组织中的表达水平差异28
• 1.2.2 验证过表达质粒pri-miR-429和ASO-miR-429的有效性28-29
• 1.2.3 miR-429抑制宫颈癌细胞HeLa和C33A的细胞活性29-30
• 1.2.4 miR-429抑制宫颈癌细胞HeLa和C33A克隆形成能力30
• 1.2.5 miR-429促进宫颈癌细胞C33A的凋亡30-31
• 1.3 小结31-32
• 二、MIR-429与IKKΒ的靶定关系32-46
• 2.1 材料和方法32-41
• 2.1.1 实验材料32
• 2.1.2 实验方法32-41
• 2.1.3 统计学分析41
• 2.2 结果41-45
• 2.2.1 miR-429靶基因的筛选41-42
• 2.2.2 EGFP荧光报告载体实验证实IKKβ是miR-429的直接靶基因42
• 2.2.3 RT-qPCR实验证实在HeLa和C33A中miR-429调控IKKβmRNA的表达水平。42-43
• 2.2.4 WB验证在HeLa和C33A中miR-429能够调节IKKβ蛋白的表达43-44
• 2.2.5 RT-qPCR检测在宫颈癌组织和癌旁正常组织中IKKβ表达水平的差异44-45
• 2.2.6 相关性分析结果显示在宫颈癌组织中miR-429表达水平与IKKβ的表达水平呈现负相关关系45
• 2.3 小结45-46
• 三、IKKΒ在宫颈癌细胞中的作用46-52
• 3.1 材料和方法46-47
• 3.1.1 实验材料46
• 3.1.2 实验方法46-47
• 3.1.3 统计学方法47
• 3.2 结果47-51
• 3.2.1 RT-qPCR实验验证IKKβ过表达质粒及敲降质粒的有效性47-48
• 3.2.2 Western Blotting验证IKKβ过表达质粒及干扰质粒的有效性48-49
• 3.2.3 MTT实验验证IKKβ促进宫颈癌细胞HeLa和C33A细胞活性49-50
• 3.2.4 集落实验验证IKKβ增强宫颈癌细胞HeLa和C33A克隆形成能力50
• 3.2.5 IKKβ抑制宫颈癌细胞C33A凋亡能力50-51
• 3.3 小结51-52
• 四、挽救实验52-57
• 4.1 材料和方法52-53
• 4.1.1 实验材料52
• 4.1.2 实验方法52-53
• 4.1.3 统计学方法53
• 4.2 结果53-56
• 4.2.1 miR-429与靶基因IKKβ对宫颈癌细胞HeLa和C33A中IKKβ蛋白表达水平的挽救实验53-54
• 4.2.2 miR-429与靶基因IKKβ对宫颈癌细胞HeLa和C33A细胞活性的挽救实验54-55
• 4.2.3 miR-429与靶基因IKKβ对宫颈癌细胞HeLa和C33A克隆形成能力的挽救实验55-56
• 4.2.4 miR-429与靶基因IKKβ对宫颈癌细胞C33A凋亡能力的挽救实验56
• 4.3 小结56-57
• 讨论57-62
• 结论62-63
• 参考文献63-68
• 发表论文和参加科研情况说明68-69
• 综述 MIR-200家族与肿瘤69-80
• 综述参考文献76-80
• 致谢80-81
• 个人简历81

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本文编号：304162