IL-17A对卵巢癌顺铂耐药的影响及其影响机制的研究

发布时间：2017-04-13 18:19

  本文关键词：IL-17A对卵巢癌顺铂耐药的影响及其影响机制的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:利用人卵巢癌细胞系、IL-17A缺陷小鼠(IL-17A-/-小鼠,deficient)及同基因小鼠卵巢癌细胞系、临床卵巢癌组织标本系统地探讨IL-17A(Interleukin-17A)对卵巢癌(ovarian cancer,OVCA)顺铂(cisplatin,DDP)耐药的影响及其可能的作用机制,为临床降低OVCA化疗耐药提供新的策略。方法:1.应用Western Blotting法检测人OVCA细胞系A2780(DDP敏感OVCA细胞株)、OVCAR3(DDP耐药OVCA细胞株)和小鼠OVCA细胞系ID8(C57BL/6背景)中IL-17A受体(IL-17RA)的表达。2.应用MTT法检测rhIL-17A对A2780和OVCAR3细胞增殖的影响。3.应用MTT法检测DDP对A2780和OVCAR3细胞的IC50。4.应用Western Blotting法检测不同剂量rhIL-17A处理不同时间对A2780和OVCAR3细胞中耐药相关分子ABCG2和MDR1表达的影响。5.应用MTT法检测rhIL-17A(1ng/ml,处理24h)对A2780和OVCAR3细胞DDP(A2780,10μM;OVCAR3,100μM)耐药(药敏)的影响,并以rhIL-17RA中和抗体(IL-17RA mAb)和Gli1抑制剂Gant61进行相应的封闭实验。6.设计和合成三对IL-17RA的特异性siRNA序列(#1、#2、#3 siIL-17RA),利用Lipofectamine TM 2000转染A2780和OVCAR3细胞。利用Western blotting法鉴定IL-17RA敲降效果。7.应用MTT法检测rhIL-17A(1ng/ml,处理24h)对#3 siIL-17RA序列转染的A2780和OVCAR3细胞DDP(A2780,10μM;OVCAR3,100μM)耐药(药敏)的影响。8.应用流式细胞仪,采用Annexin V-FITC/PI双染法,检测rhIL-17A(1ng/ml,处理24h)对DDP诱导的A2780和OVCAR3细胞(A2780,10μM;OVCAR3,100μM)凋亡的影响,并以rhIL-17RA中和抗体(IL-17RA mAb)进行相应的封闭实验。9.应用Western Blotting法检测rhIL-17A(1ng/ml,处理24h)处理A2780和OVCAR3后,对细胞中耐药相关分子ABCG2、MDR1和Hedgehog(Hh)信号通路核转录因子Gli1的表达的影响,并分别以IL-17RA mAb和Gant61进行相应的封闭实验。10.应用Western Blotting法检测rhIL-17A(1ng/ml,处理24h)对#3 siIL-17RA转染后的A2780和OVCAR3细胞中耐药相关分子ABCG2、MDR1和Gli1表达的影响。11.以C57BL/6野生型(wild type,WT)、IL-17A缺陷型(deficient,IL-17A-/-)小鼠和小鼠卵巢癌细胞系ID8建立小鼠OVCA腹腔种植瘤动物模型,并给予DDP治疗,检测内源性IL-17A对顺铂治疗OVCA疗效的影响。分别取出顺铂治疗后WT组小鼠(“WT+DDP”)和IL-17A-/-组小鼠(“deficient+DDP”)两组肿瘤组织,应用IHC技术观察瘤组织中IL-17A、ABCG2、MDR1和Gli1的表达。再分别从WT组小鼠,IL-17A-/-组小鼠,“WT+DDP”组小鼠,“deficient+DDP”组小鼠四组肿瘤组织中提取蛋白,应用Western Blotting法观察瘤组织中IL-17A、ABCG2、MDR1和Gli1的表达。12.收集55例上皮性OVCA(epithelial OVCA,EOC)患者的病理组织标本和9例正常人卵巢的组织标本,采用IHC法分析IL-17A表达与ABCG2、MDR1、Gli1的表达及与患者临床进展等的相关性。结果:1.人OVCA细胞系A2780、OVCAR3和小鼠OVCA细胞系ID8均表达IL-17RA(如图1A所示)。2.rhIL-17A对A2780和OVCAR3的细胞增殖无显著性影响(如图1B所示)。3.A2780和OVCAR3细胞的IC50分别为25.78μM和322.00μM(如图2所示)。4.rhIL-17A(1ng/ml,处理24h)可显著增加A2780和OVCAR3细胞耐药相关分子ABCG2和MDR1的蛋白表达水平(如图3所示)。5.#3 siIL-17RA序列转染A2780和OVCAR3细胞后,可显著降低IL-17RA的表达(如图5A所示)。6.rhIL-17A(1ng/ml,处理24h)对A2780和OVCAR3细胞活性无显著性影响,但可显著增加DDP降低的A2780和OVCAR3细胞活性(A2780:0.72±0.01 vs 0.49±0.02;OVCAR3:0.75±0.01 vs 0.55±0.04,P0.05),并且分别以IL-17RA mAb、IL-17RA siRNA或Gant61进行阻断实验均可消除由rhIL-17A加剧的A2780和OVCAR3细胞DDP的耐药性(IL-17RA mAb封闭实验,A2780:0.44±0.01 vs 0.72±0.01,P0.01;OVCAR3:0.63±0.01 vs0.75±0.01,P0.05,如图4所示;IL-17RA siRNA封闭实验,A2780:0.82±0.01vs 0.51±0.03,P0.01,OVCAR3:0.85±0.01 vs 0.77±0.04,P0.05,如图5B所示;Gant61封闭实验,A2780:0.48±0.02 vs 0.72±0.01;OVCAR3:0.41±0.01 vs 0.75±0.01,P0.01,如图7C所示)。7.rhIL-17A(1ng/ml,处理24h)对A2780和OVCAR3细胞凋亡无显著性影响,但可显著降低DDP诱导的A2780和OVCAR3细胞凋亡(凋亡率A2780:25.77±3.31%vs 1.03±0.67%;OVCAR3:19.20±0.98%vs 0.63±0.15%,P0.01),并且IL-17RA mAb可消除rhIL-17A降低的A2780和OVCAR3细胞DDP诱导的凋亡(A2780:14.97±0.80 vs 24.77±2.51%;OVCAR3:11.67±1.90 vs 17.97±0.72%,P0.05)(如图6所示)。8.rhIL-17A(1ng/ml,处理24h)可以促进A2780和OVCAR3细胞耐药相关分子ABCG2,MDR1和Gli1的蛋白表达水平的增加,并且分别以IL-17RA mAb、IL-17RA siRNA或Gant61进行阻断实验均可消除由rhIL-17A引起的A2780和OVCAR3细胞中ABCG2,MDR1和Gli1蛋白表达水平的增加(如图7所示)。9.以DDP处理ID8-荷瘤WT小鼠和IL-17A-/-小鼠,结果显示:(1)“WT+DDP”组小鼠的腹腔内成瘤数目显著大于“deficient+DDP”组小鼠(如图8所示);(2)IHC结果显示“WT+DDP”组小鼠肿瘤组织切片中IL-17A的表达呈强阳性,而“deficient+DDP”组小鼠肿瘤组织切片中未见到IL-17A的表达,并且“WT+DDP”组小鼠肿瘤组织中耐药相关分子ABCG2、MDR1和Gli1的表达均高于“deficient+DDP”组小鼠肿瘤组织中相应分子的表达(如图9A所示);(3)Western Blotting结果显示WT组小鼠中的耐药相关分子ABCG2、MDR1和Gli1的蛋白表达均显著高于IL-17A-/-组小鼠肿瘤组织中相应的蛋白表达,且“WT+DDP”组小鼠肿瘤组织中耐药相关分子ABCG2、MDR1和Gli1的蛋白表达均高于WT组小鼠肿瘤组织中相应蛋白的表达,而“deficient+DDP”组小鼠和IL-17A-/-组小鼠肿瘤组织中耐药相关分子ABCG2、MDR1和Gli1的蛋白表达无显著性差异(如图9B所示)。10.卵巢癌的临床病理切片分析结果显示:IL-17A表达的强弱与FIGO分期呈正相关(如图10所示);ABCG2、MDR1和Gli1的表达强弱均与FIGO分期呈正相关(如图11A所示);IL-17A表达的强弱也与ABCG2、MDR1和Gli1的表达强弱呈正相关(如图11B所示)。结论:通过临床标本、动物实验及体外机制研究,本课题组发现IL-17A可通过激活Gli1介导的Hh信号通路增加耐药相关分子ABCG2和MDR1的表达,从而加剧以DDP为基础的OVCA化疗药的耐药性。该结果可为临床降低OVCA化疗耐药性提供新的策略。
【关键词】：IL-17A DDP 耐药 卵巢癌
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.31
【目录】：

• 中文摘要4-8
• Abstract8-16
• 缩略语/符号说明16-17
• 前言17-20
• 研究现状、成果17-18
• 研究目的、方法18-20
• 一、外源性的IL-17A对人OVCA细胞顺铂耐药的影响20-48
• 1.1 对象和方法20-35
• 1.1.1 细胞系20
• 1.1.2 主要试剂20-21
• 1.1.3 主要仪器和设备21-22
• 1.1.4 主要试剂的配制22-24
• 1.1.5 细胞培养24
• 1.1.6 Western Blotting 法检测 OVCA 中是否存在 IL-17A24-25
• 1.1.7 MTT 法检测 rh IL-17A 对 A2780 和 OVCAR3 细胞增殖的影响25
• 1.1.8 MTT法检测DDP对A2780和OVCAR3的IC5025-26
• 1.1.9 Western Blotting法检测rhIL-17A对耐药相关分子ABCG2和MDR1的蛋白表达水平的影响26-27
• 1.1.10 MTT法检测rhIL-17A对A2780和OVCAR3细胞DDP耐药（药敏）的影响，并以IL-17RA mAb进行相应的封闭实验27-28
• 1.1.11 设计和合成三段针对 IL-17RA 的特异性 siRNA 序列（#1、#2、#3 siIL-17RA），利用 Lipofectamine TM 2000 转染 A2780 和 OVCAR3 细胞。利用Western blottign 法鉴定 IL-17RA 敲降结果28-29
• 1.1.12 MTT 法检测 rhIL-17A（1ng/ml，处理 24h）对#3 siIL-17RA 序列转染A2780 和 OVCAR3 细胞后 DDP（A2780，10μM；OVCAR3，100μM）耐药（药敏）的影响29-30
• 1.1.13 流式技术检测 rh IL-17A（1ng/ml，处理 24h）对 DDP 诱导的 A2780 和OVCAR3 细胞（A2780，10μM；OVCAR3，100μM）凋亡的影响，并以 rh IL-17RA中和抗体（IL-17RA m Ab）进行相应的封闭实验检测外源性的 IL-17A 对 DDP 耐药的 OVCA 的细胞凋亡的影响30-31
• 1.1.14 Western Blotting 法检测 rh IL-17A 处理 A2780 和 OVCAR3 后，对细胞中耐药相关分子 ABCG2、MDR1 和 Gli1 的表达的影响，并以 IL-17RA m Ab 进行相应的封闭实验31-32
• 1.1.15 Western Blotting 法分别检测 rh IL-17A 处理 si IL-17RA 干扰的 A2780和 OVCAR3 后，对细胞中耐药相关分子 ABCG2、MDR1 和 Gli1 的表达的影响32-33
• 1.1.16 Western Blotting 法分别检测 rhIL-17A 处理 A2780 和 OVCAR3 后，，对细胞中耐药相关分子 ABCG2、MDR1 和 Gli1 的表达的影响，并以 Gli1 抑制剂Gant61 进行相应的封闭实验33-34
• 1.1.17 MTT 法检测 rh IL-17A 对 A2780 和 OVCAR3 细胞 DDP 耐药（药敏）的影响，并以 Gli1 抑制剂 Gant61 进行相应的封闭实验34-35
• 1.1.18 统计学处理35
• 1.2 结果35-45
• 1.2.1 rhIL-17 A 对人 OVCAA2780 和 OVCAR3 的增殖的无影响35-36
• 1.2.2 DDP 对 A2780 和 OVCAR3 细胞的 IC5036-37
• 1.2.3 rhIL-17A（1ng/ml，处理 24h）可显著增加A2780和OVCAR3细胞耐药相关分子ABCG2和MDR1的蛋白表达水平37-38
• 1.2.4 rhIL-17A（1ng/ml，处理 24h）可显著增加DDP降低的A2780和OVCAR3细胞活性38-39
• 1.2.5 IL-17RA 敲降可显著性消除 rhIL-17A 促进 A2780 和 OVCAR3 细胞 DDP耐药增加的影响39-41
• 1.2.6 rhIL-17A 可通过 IL-17RA 显著性增加 DDP 诱导的 A2780 和 OVCAR3 细胞凋亡41-42
• 1.2.7 rhIL-17A 通过 Gli1 介导的 Hh 信号通路直接促进 OVCA 的 DDP 耐药42-45
• 1.3 讨论45-46
• 1.4 小结46-48
• 二、内源性的 IL-17A 对小鼠卵巢癌 DDP 耐药的影响48-59
• 2.1 对象和方法48-55
• 2.1.1 细胞株48
• 2.1.2 实验动物48
• 2.1.3 主要试剂48-49
• 2.1.4 主要仪器和设备49
• 2.1.5 主要试剂的配制49-51
• 2.1.6 小鼠卵巢癌模型的构建及 DDP 治疗51-52
• 2.1.7 免疫组化技术观察瘤组织中IL-17A、ABCG2、MDR1和Gli1的表达52-53
• 2.1.8 Western Blotting法观察瘤组织中IL-17A、ABCG2、MDR1和Gli1的表达53-54
• 2.1.9 统计学处理54-55
• 2.2 结果55-58
• 2.2.1 “WT+DDP”组小鼠的腹腔内成瘤数目显著大于“deficient+DDP”组小鼠55-56
• 2.2.2 内源性的 IL-17A 可促进小鼠卵巢癌的 DDP 耐药56-58
• 2.3 讨论58
• 2.4 小结58-59
• 三、IL-17A 的表达，ABCG2、MDR1、Gli1 的表达与临床进展等的相关性59-69
• 3.1 对象和方法59-64
• 3.1.1 组织标本59
• 3.1.2 主要试剂59-60
• 3.1.3 主要试剂的配制60-61
• 3.1.4 免疫组化技术观察病理切片组织中IL-17A、ABCG2、MDR1和Gli1的表达61-63
• 3.1.5 统计学处理63-64
• 3.2 结果64-68
• 3.2.1 IL-17A表达的强弱与FIGO分期呈正相关64-66
• 3.2.2 ABCG2、MDR1 和 Gli1 的表达与 IL-17A 表达呈正相关66-68
• 3.3 结果68
• 3.4 小结68-69
• 结论69-70
• 参考文献70-75
• 发表论文和参加科研情况说明75-76
• 综述 IL-17A对卵巢癌DDP治疗耐药的影响76-83
• 综述参考文献80-83
• 致谢83-84
• 个人简历84

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