天冬酰胺合成酶在卵巢癌中的作用及表达调控研究

发布时间：2021-02-28 07:57

  卵巢癌是病死率最高的妇科恶性肿瘤,严重威胁女性的生命健康。迄今为止,已有大量研究表明,天冬酰胺合成酶（ASNS）在多种类型的恶性肿瘤的发生发展中发挥着关键作用,而其在卵巢癌中的研究却知之甚少。因此,本论文主要探讨了ASNS在卵巢癌中的表达水平、作用及其表达调控研究。ASNS在哺乳动物的器官中普遍存在,主要的生物学功能是依赖谷氨酰胺合成天冬酰胺。已有研究表明,天冬酰胺在调节细胞适应谷氨酰胺剥夺的过程中具有不可替代的作用。大多数肿瘤细胞往往具有谷氨酰胺成瘾性,在肿瘤的发生发展过程中,谷氨酰胺代谢起着至关重要的作用。作为谷氨酰胺代谢的关键酶,谷氨酰胺酶（GLS）成为癌症治疗的新靶点。因此,GLS抑制剂的研究成为了热点。我们研究发现,GLS抑制或敲低能够上调卵巢癌细胞中的ASNS。那么,GLS与ASNS是否存在某种联系?ASNS的表达调控是怎样的?此外,我们已有实验结果表明卵巢癌中ASNS具有促肿瘤作用,那么将天冬酰胺合成和谷氨酰胺利用双重阻断是否对卵巢癌有更好的治疗效果?因此,我们就以上疑问进行探究,开展了以下工作,获得了一系列结果:1.ASNS在卵巢癌组织和细胞系中的表达存在差异采用实时荧光定量PCR和Western blotting的方法分析ASNS在卵巢癌中的表达情况,结果显示ASNS在不同的卵巢癌患者组织样本和不同类型的卵巢癌细胞系中的表达具有差异,说明存在广泛的异质性。通过TCGA数据库分析得出ASNS的表达水平与预后具有相关性,且具有统计学意义,结果显示ASNS低表达的卵巢癌患者无病生存期明显延长。2.ASNS在卵巢癌中发挥促肿瘤作用MTT和平板克隆形成实验结果显示敲低ASNS显著抑制卵巢癌细胞增殖,表明ASNS在卵巢癌中发挥促肿瘤作用。而外源性补充天冬酰胺能够拯救ASNS敲低引起的增殖抑制,谷氨酸不可以,说明ASNS敲低引起的增殖抑制是由于天冬酰胺的缺乏,且天冬酰胺在卵巢癌的增殖中发挥重要的作用。流式细胞仪分析细胞周期分布,发现ASNS敲低的A2780细胞G1期阻滞,而且外源性添加天冬酰胺可以逆转这一现象,而在HO8910细胞中ASNS敲低并未对周期产生影响。由于卵巢癌细胞存在异质性,ASNS敲低抑制细胞增殖的途径不同,ASNS敲低的A2780细胞通过诱导细胞周期停滞抑制细胞增殖,而ASNS敲低的HO8910细胞的增殖抑制的机制还未明确。3.ASNS的底物谷氨酰胺水平影响其表达采用实时荧光定量PCR和Western blotting的方法检测GLS抑制剂CB-839处理后卵巢癌细胞中ASNS的表达情况,结果显示谷氨酰胺代谢抑制后,ASNS mRNA和蛋白表达水平均明显升高。同时,采用小干扰RNA敲低GLS也显示ASNS表达升高。此外,通过无谷氨酰胺培养基处理卵巢癌细胞发现,ASNS mRNA水平升高,而蛋白水平降低,呈现相反的趋势,分析可能的原因是,谷氨酰胺剥夺后由于氨基酸反应激活ATF4从而诱导ASNS转录,而由于底物减少或者是蛋白合成受阻使得ASNS的蛋白水平下降。以上结果均表明,作为ASNS的关键底物,谷氨酰胺水平影响ASNS的表达。4.ASNS的产物天冬酰胺水平影响其表达,而谷氨酸不影响采用实时荧光定量PCR和Western blotting的方法检测外源性补充天冬酰胺后ASNS的表达情况,结果显示天冬酰胺水平升高后抑制ASNS表达,而且外源性补充天冬酰胺能够部分逆转GLS抑制所引起的ASNS的上调。作为ASNS催化反应的另一个产物,谷氨酸并不影响ASNS的表达,且不能逆转GLS抑制所引起的ASNS的上调。说明GLS活性抑制时,肿瘤细胞可能通过上调ASNS来利用谷氨酰胺合成大量天冬酰胺。5.天冬酰胺合成和谷氨酰胺利用双重阻断的肿瘤抑制作用MTT和平板克隆形成实验结果均显示ASNS敲低和GLS抑制剂联合能够增强对卵巢癌细胞的增殖抑制作用。流式细胞仪分析细胞周期分布,发现ASNS敲低和GLS抑制剂联合进一步诱导A2780细胞G1期阻滞,而在HO8910细胞中仍未对周期产生影响。同时,检测ROS水平发现ASNS敲低和GLS抑制剂联合诱导卵巢癌细胞ROS升高。以上结果表明,卵巢癌细胞增殖抑制的途径不同,A2780细胞的增殖抑制主要通过诱导细胞周期停滞途径,可能部分通过诱导ROS升高,而HO8910细胞则可能通过诱导ROS升高来抑制细胞增殖。总之,本论文明确了ASNS在卵巢癌中的促肿瘤作用,并且表明其与预后密切相关,同时发现谷氨酰胺和天冬酰胺水平均调控ASNS的表达,提出了ASNS抑制与GLS抑制联合治疗卵巢癌的可能性,从而为卵巢癌的治疗提供新的方向和策略,有助于新的生物标志物和治疗靶点的发现和应用。




本文编号：3055555