二甲双胍通过p38MAPK信号通路抑制ERCC1基因逆转卵巢癌细胞的顺铂耐药性

发布时间：2017-04-23 23:11

  本文关键词：二甲双胍通过p38MAPK信号通路抑制ERCC1基因逆转卵巢癌细胞的顺铂耐药性，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景卵巢癌是目前死亡率最高的妇科恶性肿瘤,严重威胁妇女生命和健康,恶性程度高、起病隐匿、发病晚、易转移、预后差是卵巢癌的特点。大约70%的患者因为腹水、腹痛等原因就诊时已经是晚期(FIGO分级Ⅲ-Ⅳ期)。肿瘤细胞减灭术和以顺铂为基础的联合化疗是晚期卵巢上皮性癌综合治疗的重要手段[1],肿瘤细胞减灭术的目的是最大限度和范围地切除肿瘤组织,但多年临床经验表明,术后可能残留的病灶仍然无法避免,且成为卵巢癌复发的重要因素。因此化疗的应用使卵巢癌的治疗效果大为改观,患者生存质量明显改善,但综合来看,患者5年内的生存率仍徘徊于30~40%,卵巢癌对化疗药物耐药是导致患者治疗失败的主要原因。目前卵巢上皮性癌主要采用以顺铂为基础的化疗方案,顺铂通过使肿瘤细胞形成DNA加合物,造成肿瘤细胞的DNA损伤,继而使肿瘤细胞DNA的复制被抑制,细胞分裂再生停止,最终杀灭肿瘤细胞。然而,顺铂的疗效会因癌细胞内在或者后天(药物诱导)获得的耐药性而减弱。到目前为止,对顺铂的体内耐药机制并不完全清楚,但是其中核苷酸切除修复(nucleotide excision repair,NER)途径对铂类药物形成的DNA加合物的切割修复在肿瘤对铂类药物的耐药过程中起着非常重要的作用[2],而在NER途径中的切除修复交叉互补蛋白1(excision repair crosscomp lementing p rotein1,ERCC1)是最重要的一个修复蛋白。ERCC1在降低肿瘤细胞对铂类化疗药物的一个可能性是因为它能够及时地修复铂类造成的DNA损伤[3]。沉默或干扰掉ERCC1基因可以增加卵巢癌细胞对顺铂的敏感性[4]。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kases,MAPK)信号通路在多种恶性肿瘤(包括卵巢癌)细胞的增殖、凋亡和化疗药物作用及化疗药物耐受发生中起重要作用[5-7],在多数肿瘤中都存在不正常激活或异常表达。有研究表明,p38MAPK信号通路的过度激活能够导致卵巢癌的发生和影响其预后[8]。MAPK信号通路在非小细胞癌等多种肿瘤细胞的ERCC1基因高表达中起到重要作用[9]。二甲双胍是一种常规用于治疗2型糖尿病的口服降糖药[10,11]。最近两项大型流行病学调查研究表明:长期服用二甲双胍能够降低卵巢癌的发病率,而且二甲双胍能够显著延长卵巢癌合并糖尿病患者的无进展生存期[12]。在体内外实验研究中,二甲双胍能够抑制包括卵巢癌在内的多种肿瘤细胞的生长和发展[13,14]。特别是二甲双胍能够增加非小细胞癌细胞、卵巢癌细胞等对化疗药物的敏感性[15],已有报道称,二甲双胍能够改善乳腺癌化疗药物耐药的耐药性,但具体机制不明[16]。本研究通过CCK-8法检测人上皮性卵巢癌细胞耐药株细胞C13K和CP70细胞的增殖、顺铂耐药性及二甲双胍对其的顺铂耐药性改变,应用si RNA转染技术分别抑制耐药细胞株中ERCC1、p38MAPK基因的表达,RT-PCR法检测应用二甲双胍前后的耐药细胞中的ERCC1基因的m RNA的表达情况,同时western blot方法检测ERCC1、AMPK、p-AMPK、p38MAPK及p-p38MAPK蛋白的表达,探讨ERCC1基因对卵巢癌细胞顺铂耐药性的影响,以及二甲双胍应用后卵巢癌细胞顺铂耐药性的变化情况,试图进一步了解二甲双胍能否改善顺铂耐药性,以及以及是否通过调节p38MAPK信号通路降低细胞中ERCC1基因的表达从而发挥作用,以期对卵巢癌的化学治疗提供新的理论依据。目的通过细胞增殖实验(CCK-8)、荧光定量PCR、western blot技术分析二甲双胍对卵巢癌细胞顺铂耐药株耐药性的改善,以及通过si RNA转染技术分别抑制耐药细胞中ERCC1和p38MAPK基因的表达,分析二甲双胍影响卵巢癌以上生物学行为的分子机制,为逆转卵巢癌耐药研究以及临床应用提供一个新的思路。方法1.siRNA转染抑制C13K和CP70细胞中ERCC1、p38MAPK基因的表达;2.细胞增殖法(CCK-8)检测转染ERCC1si RNA前后耐药细胞的顺铂耐药性的改变、二甲双胍对耐药细胞顺铂耐药性的改善;3.应用荧光定量PCR(RT-PCR)或/和蛋白免疫印迹(Western blot)法检测二甲双胍作用前后耐药细胞中ERCC1的表达改变、AMPK信号通路、p38MAPK信号通路变化情况;3.统计学处理:利用SPSS17.0软件对结果数据进行统计分析。所有实验均独立重复3次,多组间数据采用单因素方差分析,然后组间两两比较采用LSD-t法进行比较。依P0.05为差异有统计学意义。结果1.二甲双胍能够逆转C13K和CP70细胞对顺铂的耐药性(P0.05)。2.二甲双胍作用能够降低C13K和CP70细胞中ERCC1 m RNA和蛋白的表达水平(P0.001),并激活AMPK信号通路(P0.01);而联合应用AMPK信号通路阻断剂Compound C可以阻断二甲双胍的这种作用(即ERCC1蛋白表达升高)(P0.001)。3.p38MAPK信号通路抑制剂SB203580作用耐药后,细胞中ERCC1蛋白表达水平降低(P0.05);而二甲双胍作用可降低p38MAPK的磷酸化水平(P0.001),抑制p38MAPK信号通路;二甲双胍作用转染了p38MAPK si RNA的C13K和CP70细胞后,ERCC1蛋白的表达水平无明显变化(P0.05)。结论1、ERCC1基因可能参与卵巢癌C13K和CP70细胞对顺铂的耐药性形成;2、二甲双胍能够逆转C13K和CP70细胞的顺铂耐药性;3、二甲双胍可能通过调节AMPK信号通路、p38MAPK信号通路调节C13K和CP70细胞的顺铂耐药性。
【关键词】：卵巢癌 二甲双胍 顺铂耐药 ERCC1基因 p38MAPK信号通路
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.31
【目录】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-13
• 引言13-16
• 1 材料和方法16-31
• 1.1 实验材料16-19
• 1.1.1 主要试剂16-17
• 1.1.2 主要仪器及耗材17-18
• 1.1.3 研究对象18
• 1.1.4 试剂配制18-19
• 1.2 实验方法19-29
• 1.2.1 细胞培养19-21
• 1.2.2 CCK-8 法细胞增殖实验21-22
• 1.2.3 siRNA转染22-24
• 1.2.4 荧光定量PCR（qRT-PCR）24-26
• 1.2.5 蛋白免疫印迹实验（Western Blot）26-29
• 1.3 统计学分析29-31
• 2 结果31-41
• 3 讨论41-47
• 3.1 卵巢癌的化疗药物耐药相关机制41-42
• 3.2 顺铂耐药相关的ERCC1 基因42-43
• 3.3 二甲双胍43-44
• 3.4 与耐药相关的P38MAPK信号通路44-45
• 3.5 逆转耐药的现状及展望45-46
• 3.6 总结46-47
• 结论47-48
• 参考文献48-52
• 综述 二甲双胍的抗肿瘤作用52-65
• 参考文献61-65
• 个人简历及发表论文情况65-66
• 个人简历65
• 发表论文情况65-66
• 致谢66

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 李海文;徐祖敏;余忠华;;二甲双胍在肿瘤放射增敏治疗中研究进展[J];中华实用诊断与治疗杂志;2014年04期

2 郏文亭;兰玲;钱玮;杨雪阳;郑旭琴;徐宽枫;崔岱;;降糖药二甲双胍对甲状腺未分化癌细胞增殖及凋亡的作用[J];南京医科大学学报(自然科学版);2014年04期

3 张箴波;廖虹;杨树栋;董玲玲;隋龙;丰有吉;;二甲双胍在肿瘤治疗中的机制研究进展[J];现代生物医学进展;2010年17期

中国博士学位论文全文数据库 前4条

1 黄为;二甲双胍对胆管癌细胞株RBE的作用及其机制研究[D];中南大学;2012年

2 邢立杰;1、第一部分 二甲双胍对B淋巴细胞增殖性疾病作用的研究2、第二部分 B淋巴细胞增殖性疾病MYD88L265突变的研究3、第三部分 初治多发性骨髓瘤患者血清IL-6预后意义研究[D];北京协和医学院;2013年

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4 李伟宁;二甲双胍对HaCaT细胞增殖信号通路及豚鼠耳银屑病模型影响研究[D];山东大学;2014年

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5 朱智峰;二甲双胍对结肠癌细胞SW480增殖、周期及凋亡的影响[D];辽宁医学院;2012年

6 崔鹏飞;低浓度二甲双胍联合吉西他滨对Aspc-1细胞增殖和侵袭能力的影响及可能作用机制[D];华中科技大学;2012年

7 张贝贝;二甲双胍在卵巢癌细胞SKOV3体外增殖及凋亡中的作用[D];吉林大学;2013年

8 谢颖;二甲双胍和甘精胰岛素对人子宫内膜癌Ishikawa细胞株增殖作用的影响及其相关机制研究[D];南昌大学医学院;2013年

9 徐学超;二甲双胍诱导胃癌细胞MKN-45发生细胞自噬及其机制的研究[D];兰州大学;2014年

10 陈荣川;二甲双胍联合塞来昔布对肺癌细胞A549增殖和凋亡作用的实验研究[D];大理学院;2014年

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本文编号：323171