子宫内膜异位症患者间质细胞Ras调控ERK/NF-кB通路影响细胞增殖及侵袭性的机制研究
发布时间：2021-08-05 07:40
目的1.探讨子宫内膜异位症在位内膜间质细胞中Ras基因表达与ERK/NF-кB通路之间表达的相关性及可能机制;2.探讨Ras基因调控ERK/NF-кB通路影响在位内膜间质细胞增殖、侵袭性的变化。方法1.选取2018年9月至2019年6月宁夏医科大学总医院妇科“腹腔镜卵巢囊肿剥除”、术后病理科诊断子宫内膜异位症的育龄期妇女患者15例,术中取得在位子宫内膜组织。分离、培养、提纯在位内膜间质细胞,稳定传代后通过细胞免疫化学及细胞免疫荧光化学进行间质细胞鉴定。2.细胞免疫荧光化学检测细胞中Ras、ERK及NF-кB表达情况;构建过表达PAQR3慢病毒（特异性抑制Ras）,筛选MOI值转染15例子宫内膜异位症患者在位内膜间质细胞,设立病毒组（过表达PAQR3慢病毒）、空载组（空慢病毒载体）、空白组（同等条件下未添加任何干预）;采用RT-PCR及Western-Blot分别检测慢病毒转染前后Ras、ERK、NF-кB基因mRNA及蛋白表达情况;分别构建ERK siRNA及NF-кB siRNA,转染相同15例子宫内膜异位症患者在位内膜间质细胞;设立转染组（ERK siRNA/NF-кB siRNA...
【文章来源】：宁夏医科大学宁夏回族自治区
【文章页数】：56 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
子宫内膜在位内膜间质
宁夏医科大学硕士研究生学位论文材料与方法85min；3）将上层培养基弃掉，加入配置好的培养基，在显微镜下计数细胞，将细胞接种到培养皿中，置于细胞培养箱中，每隔一天更换一次培养液，观察细胞的生长情况。3.2免疫细胞化学鉴定间质细胞根据不同细胞表面特异性标志分子不同进行细胞鉴定，间质细胞为波形蛋白阳性，而腺上皮细胞为角蛋白阳性。高压灭菌消毒的盖玻片小心置于6孔培养皿，细胞计数2×104/ml后接种于培养皿，培养6h，观察细胞贴壁50%后，PBS清洗3次各1min，4%多聚甲醛固定15min；室温干燥5min；PBS清洗3次各1min；加入过氧化酶阻断剂37℃30min；PBS清洗3次各1min；非免疫性动物血清滴加后置于37℃30min；一抗孵育（PBS配波形蛋白1:500角蛋白1:50，湿盒）4℃过夜；阴性对照用PBS液；PBS清洗标本3次各1min；二抗孵育（湿盒）37℃30min；PBS清洗标本3次各1min；链霉素抗生物蛋白-过氧化物酶37℃30min；PBS清洗3次各5min；DAB显色显微镜下观察呈棕色，静置3-10min；蒸馏水洗2次1min；苏木素复染30s；自来水洗10min；95%乙醇脱水1-2s，树胶封片后置于显微镜下观察。在位子宫内膜间质细胞呈现波形蛋白染色阳性，角蛋白阴性。波形蛋白组细胞呈梭形，核圆居中，细胞质及细胞核均染棕黄色，波形蛋白染色阳性；角蛋白及PBS组细胞梭形，未见胞质及胞核染色，角蛋白及PBS染色阴性。取10个不同视野进行间质细胞计数，计算细胞纯度（93±0.17）%。（见图1）ABC图1：子宫内膜在位内膜间质细胞免疫细胞化学鉴定（×50）A:vimentin组染色阳性;B:keratin组染色阴性;C：PBS组空白对照阴性
宁夏医科大学硕士研究生学位论文材料与方法10图2：子宫内膜在位内膜间质细胞免疫化学荧光鉴定（×50）A:vimentin荧光染色阳性;B:keratin荧光染色阴性;C：PBS空白对照阴性3.6MOI值测定生长状态良好内异症间质细胞接种于96孔板，细胞贴壁过夜，取10μl带有GFP（GreenFluorescentProtein，绿色荧光蛋白）的空载慢病毒加90μl培养液，以1:100为起点进行梯度稀释。取出过夜96孔板，弃去废旧培养液，加入配置好病毒稀释液，保留未加入病毒的细胞孔作为对照。在感染细胞后48、72、96、120h分别通过倒置荧光显微镜下观察细胞转染效果，以MOI转染细胞80%以上为最佳MOI，结果显示间质细胞慢病毒转染最佳MOI=50。3.7慢病毒转染每皿3x105个细胞接种3.5cm培养皿3皿，37°5%CO2培养箱中过夜，待细胞贴壁30-50%，每皿添加无血清培养基1ml进行换液，取最佳转染MOI进行慢病毒转染，37°5%CO2培养箱8-12h后，继续添加2ml含血清培养基，置37°5%CO2培养箱，根据细胞状态进行细胞换液，培养72h后观察细胞荧光情况，后续进行细胞传代时加入含2ug/ml嘌呤霉素进行筛选阳性克隆株。3.8siRNA干扰细胞使用无血清培养基细胞接种于6孔板后置于37℃5%CO2培养箱，培养24h后观察达80%-90%融合度，将30ulLipofectamineRNAiMAX添加入1500μlOpti-MEM无血清培养基中进行稀释，另外，分别将8ulsiRNA加入250ulOpti-MEM无血清培养基中，于室温下，放置5min后与LipofectamineRNAiMAX缓慢轻柔的相混合，室温下放置20min，将配制好的混合物添加入含1.5ml无血清培养液的6孔板中。在培养箱中培养6-8h后更换培养基，分别在12h、
【参考文献】：
期刊论文
[1]阻断MAPK信号通路对异位子宫内膜间质细胞NF-κB、Bcl-2和p21表达的影响[J]. 刘晓娟,贺英,王虹. 广东医学. 2015(06)
[2]子宫内膜异位症性不孕症与MMP-2及性激素的关系[J]. 谭毅,黄荷凤,朱依敏,洪丽华,张文悫. 中国现代医学杂志. 2002(14)
本文编号：3323362
【文章来源】：宁夏医科大学宁夏回族自治区
【文章页数】：56 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
子宫内膜在位内膜间质
宁夏医科大学硕士研究生学位论文材料与方法85min；3）将上层培养基弃掉，加入配置好的培养基，在显微镜下计数细胞，将细胞接种到培养皿中，置于细胞培养箱中，每隔一天更换一次培养液，观察细胞的生长情况。3.2免疫细胞化学鉴定间质细胞根据不同细胞表面特异性标志分子不同进行细胞鉴定，间质细胞为波形蛋白阳性，而腺上皮细胞为角蛋白阳性。高压灭菌消毒的盖玻片小心置于6孔培养皿，细胞计数2×104/ml后接种于培养皿，培养6h，观察细胞贴壁50%后，PBS清洗3次各1min，4%多聚甲醛固定15min；室温干燥5min；PBS清洗3次各1min；加入过氧化酶阻断剂37℃30min；PBS清洗3次各1min；非免疫性动物血清滴加后置于37℃30min；一抗孵育（PBS配波形蛋白1:500角蛋白1:50，湿盒）4℃过夜；阴性对照用PBS液；PBS清洗标本3次各1min；二抗孵育（湿盒）37℃30min；PBS清洗标本3次各1min；链霉素抗生物蛋白-过氧化物酶37℃30min；PBS清洗3次各5min；DAB显色显微镜下观察呈棕色，静置3-10min；蒸馏水洗2次1min；苏木素复染30s；自来水洗10min；95%乙醇脱水1-2s，树胶封片后置于显微镜下观察。在位子宫内膜间质细胞呈现波形蛋白染色阳性，角蛋白阴性。波形蛋白组细胞呈梭形，核圆居中，细胞质及细胞核均染棕黄色，波形蛋白染色阳性；角蛋白及PBS组细胞梭形，未见胞质及胞核染色，角蛋白及PBS染色阴性。取10个不同视野进行间质细胞计数，计算细胞纯度（93±0.17）%。（见图1）ABC图1：子宫内膜在位内膜间质细胞免疫细胞化学鉴定（×50）A:vimentin组染色阳性;B:keratin组染色阴性;C：PBS组空白对照阴性
宁夏医科大学硕士研究生学位论文材料与方法10图2：子宫内膜在位内膜间质细胞免疫化学荧光鉴定（×50）A:vimentin荧光染色阳性;B:keratin荧光染色阴性;C：PBS空白对照阴性3.6MOI值测定生长状态良好内异症间质细胞接种于96孔板，细胞贴壁过夜，取10μl带有GFP（GreenFluorescentProtein，绿色荧光蛋白）的空载慢病毒加90μl培养液，以1:100为起点进行梯度稀释。取出过夜96孔板，弃去废旧培养液，加入配置好病毒稀释液，保留未加入病毒的细胞孔作为对照。在感染细胞后48、72、96、120h分别通过倒置荧光显微镜下观察细胞转染效果，以MOI转染细胞80%以上为最佳MOI，结果显示间质细胞慢病毒转染最佳MOI=50。3.7慢病毒转染每皿3x105个细胞接种3.5cm培养皿3皿，37°5%CO2培养箱中过夜，待细胞贴壁30-50%，每皿添加无血清培养基1ml进行换液，取最佳转染MOI进行慢病毒转染，37°5%CO2培养箱8-12h后，继续添加2ml含血清培养基，置37°5%CO2培养箱，根据细胞状态进行细胞换液，培养72h后观察细胞荧光情况，后续进行细胞传代时加入含2ug/ml嘌呤霉素进行筛选阳性克隆株。3.8siRNA干扰细胞使用无血清培养基细胞接种于6孔板后置于37℃5%CO2培养箱，培养24h后观察达80%-90%融合度，将30ulLipofectamineRNAiMAX添加入1500μlOpti-MEM无血清培养基中进行稀释，另外，分别将8ulsiRNA加入250ulOpti-MEM无血清培养基中，于室温下，放置5min后与LipofectamineRNAiMAX缓慢轻柔的相混合，室温下放置20min，将配制好的混合物添加入含1.5ml无血清培养液的6孔板中。在培养箱中培养6-8h后更换培养基，分别在12h、
【参考文献】：
期刊论文
[1]阻断MAPK信号通路对异位子宫内膜间质细胞NF-κB、Bcl-2和p21表达的影响[J]. 刘晓娟,贺英,王虹. 广东医学. 2015(06)
[2]子宫内膜异位症性不孕症与MMP-2及性激素的关系[J]. 谭毅,黄荷凤,朱依敏,洪丽华,张文悫. 中国现代医学杂志. 2002(14)
本文编号：3323362
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