敲低和敲除OPTN基因SKOV3细胞的构建及其对抗癌药物敏感性的影响

发布时间：2021-09-07 12:54

　　目的利用RNA干扰技术建立稳定敲低OPTN蛋白的人SKOV3细胞株和利用CRISPR/Cas 9基因编辑技术建立稳定敲除OPTN蛋白的人SKOV3细胞株,并研究降低OPTN基因表达对细胞抗癌药物敏感性的影响。方法针对OPTN基因设计shRNA和sgRNA的序列,并与慢病毒载体质粒pGPU 6_GFP_Neo和敲除质粒PX 459载体连接产生重组载体。并将重组的质粒测序验证,将测序成功的重组质粒载体与包装质粒（psPAX 2、pMD 2.G）共转染293 T细胞进行病毒包装,收集病毒上清液并感染SKOV3细胞,获得稳定敲低和稳定敲除OPTN基因的SKOV3细胞株。RT-PCR检测敲低组OPTN基因的表达的变化,PCR检测敲除组的基因组DNA的变化,Western blot法分析检测OPTN蛋白的表达情况。MTT法检测DDP对卵巢癌细胞增殖的影响,qRT-PCR检测caspase3、Bax、Bcl-2的mRNA的表达情况,Western blot检测caspase3、Bax、和Bcl-2蛋白的表达情况。结果成功构建慢病毒载体和基因敲除载体,在SKOV... 

【文章来源】：安徽医科大学学报. 2020,55(09)北大核心

【文章页数】：6 页

【部分图文】：

重组质粒的测序结果

将经筛选后的敲除组SKOV3细胞利用天根生化科技公司的细胞基因组DNA的提取试剂盒,按照其说明书提取SKOV3细胞的基因组DNA,根据设计的引物序列进行PCR验证。结果显示与WT组相比KO组没有P出条带,说明在靶点附近的DNA片段被敲除。见图3。图3 敲除OPTN在基因组DNA水平上的鉴定

敲除OPTN在基因组DNA水平上的鉴定

【参考文献】：
期刊论文
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[3]利用CRISPR/Cas9技术构建ATF4基因敲除的HepG2细胞株[J]. 易桥勇,王秋雁,李天宇.  广西医科大学学报. 2018(05)
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[5]RNA干扰ERCC1基因表达对人卵巢癌耐药细胞DDP、PGPIPN敏感性的影响[J]. 雷婷,秦宜德,刘琛,周娟,赵梦静.  安徽医科大学学报. 2015(06)



本文编号：3389584