白藜芦醇影响核仁功能及其分子机制的研究

发布时间：2017-05-02 16:00

  本文关键词：白藜芦醇影响核仁功能及其分子机制的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究目的初步探讨白藜芦醇(resveratrol,简称Res)对核仁功能的影响和其如何通过PI3K/Akt这个信号通路来影响核仁功能的。方法和结果1.通过MTT、细胞克隆形成和DAPI染色技术检测Res对细胞增殖率、克隆形成和细胞凋亡的影响,结果表明100μmol/L的Res作用48h即可以抑制HeLa细胞的增殖和克隆形成,并在400μmol/L及其以上浓度时完全抑制HeLa细胞的增殖和克隆形成。2.通过Luciferase Assay技术、CHIP技术和Realtime PCR技术检测Res对HeLa细胞内rDNA启动子活性、HeLa细胞内转录因子在rDNA上的富集倍数和pre-rRNA表达的影响,结果表明：Res作用3h后即可抑制HeLa细胞内rDNA启动子活性；Res作用12h后,随着浓度的增加,转录因子UBF和RNA聚合酶I的亚基RPA194在rDNA上的富集倍数逐渐降低,换言之,即转录因子UBF和RNA聚合酶的亚基RPA194的活性降低；12h后对pre-rRNA的表达量相对不加药组抑制率达70%左右,并呈现浓度和时间依赖趋势。3.通过Western Blotting技术检测Res对和PI3K/Akt信号通路上的主要成员的表达及活化情况,结果表明：随着浓度的增加和作用时间的延长,HeLa细胞内PI3K/Akt这个信号通路上主要成员UBF和Akt的表达无较大改变,但其活化水平显著降低,并呈现浓度和时间依赖趋势；与抑制剂PI3Kα、PI3Kβ和Ly294002抑制效果的结果比较表明：抑制剂PI3K a的抑制效果最好,这就说明PI3K/Akt信号通路上的,起主要作用的是启始位点的PI3Kα亚型。4.通过Luciferase Assay技术、CHIP技术、Realtime PCR技术和Western Blotting技术检测Res对PI3K α亚型活化后的HeLa细胞的影响,结果表明：Res可以抑制PI3K/Akt信号通路活化后rDNA启动子的活性,降低RNA聚合酶I的亚基RPA194的活性,下调pre-rRNA的表达,抑制PI3K/Akt这个信号通路上主要成员UBF和Akt的活化。结论Res能有效抑制HeLa细胞的增殖并促进HeLa细胞的凋亡,降低rDNA启动子的活性,降低转录因子UBF和RNA聚合酶I的亚基RPA194的活性,下调pre-rRNA的表达水平,降低PI3K/Akt信号通路中UBF与Akt的磷酸化水平,对完全活化的PI3K α亚型亦有明显的抑制作用。
【关键词】：HeLa Res PI3K/Akt PIK3CA
【学位授予单位】：广州中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.33
【目录】：

• 中文摘要3-4
• Abstract4-9
• 引言9-13
• 第一部分 白藜芦醇对HeLa细胞的生长、增殖和凋亡影响13-21
• 1 材料13-14
• 1.1 试剂及耗材13
• 1.2 仪器13
• 1.3 实验所用细胞系13
• 1.4 主要试剂和溶液的配制13-14
• 2 方法14-16
• 2.1 HeLa宫颈癌细胞株的培养14
• 2.2 细胞增殖率的测定(MTT比色法)即四甲基偶氮唑蓝比色分析法测定14-15
• 2.3 细胞克隆形成试验15
• 2.4 细胞凋亡实验15-16
• 3 结果16-19
• 3.1 Res对HeLa细胞增殖的影响16-17
• 3.2 Res对HeLa细胞克隆形成的影响17-18
• 3.3 Res对HeLa细胞凋亡的影响18-19
• 4 讨论19-21
• 第二部分 白藜芦醇对核仁功能的影响21-29
• 1 材料21
• 1.1 主要试剂和耗材21
• 1.2 主要仪器21
• 1.3 主要溶液配制21
• 2 实验方法21-24
• 2.1 荧光素酶检测技术(Luciferase Assay)检测HeLa细胞中核糖体DNA(rDNA)启动子的活性21-22
• 2.2 染色质免疫沉淀技术(Chromatin Immunoprecipitation,简称CHIP)检测Res调控的转录因子UBF和RNA聚合酶I的亚基RPA194的活性22-23
• 2.3 Realtime-PCR检测HeLa细胞中pre-rRNA的水平23-24
• 2.4 Realtime-PCR检测血清刺激的HeLa细胞中pre-rRNA的水平24
• 3 结果24-27
• 3.1 Res对HeLa细胞内rDNA启动子活性的影响25
• 3.2 Res对HeLa细胞内转录因子UBF和RNA聚合酶I的亚基RPA194活性的影响25-26
• 3.3 Res对HeLa细胞内pre-rRNA表达量的影响26
• 3.4 Res对血清刺激的HeLa细胞的pre-rRNA的表达量的影响26-27
• 4 讨论27-29
• 第三部分 白藜芦醇调控PI3K/Akt信号通路中主要成员UBF和Akt的表达和活化29-37
• 1 材料29-30
• 1.1 主要试剂和耗材29
• 1.2 主要仪器29
• 1.3 主要溶液配制29-30
• 2 主要实验方法30-33
• 2.1 Western Blotting技术检测同一浓度的Res作用不同时间后,HeLa细胞中UBF和Akt的表达和活化情况30-31
• 2.2 Western Blotting技术检测不同浓度的Res作用于HeLa细胞相同时间后,UBF和Akt的表达和活化情况31
• 2.3 Western Blotting技术检测同一浓度的Res作用于饥饿24h后血清刺激不同时间的HeLa细胞后,UBF和Akt的表达和活化情况31-32
• 2.4 Western Blotting技术检测不同浓度的Res作用于饥饿24h后血清刺激相同时间的HeLa细胞后,UBF和Akt的表达和活化情况32
• 2.5 Western Blotting技术检测Res与抑制剂PI3K α、PI3K β、Ly294002分别作用于饥饿24h后血清刺激的HeLa细胞,UBF和Akt表达和活化情况32-33
• 3 结果33-36
• 3.1 Western Blotting技术检测同一浓度的Res作用不同时间后,HeLa细胞中UBF和Akt的表达和活化情况33
• 3.2 Western Blotting技术检测不同浓度的Res作用于HeLa细胞相同时间后,UBF和Akt的表达和活化情况33-34
• 3.3 Western Blotting技术检测同一浓度的Res作用于饥饿24h后血清刺激不同时间的HeLa细胞后,UBF和Akt的表达和活化情况34
• 3.4 Western Blotting技术检测不同浓度的Res作用于饥饿24h后血清刺激3h的HeLa细胞中UBF和Akt的表达和活化情况34-35
• 3.5 Western Blotting技术检测Res与抑制剂PI3K α、PI3K β、Ly294002分别作用于饥饿24h后血清刺激不同时间的HeLa细胞内UBF和Akt表达和活化情况35-36
• 4 讨论36-37
• 第四部分 白藜芦醇对完全活化的PBaBe Puro HAPIK3 CA(简称PIK3CA)质粒活性的影响37-42
• 1 材料37
• 1.1 主要试剂和耗材37
• 1.2 主要仪器37
• 1.3 主要溶液配制37
• 2 主要实验方法37-39
• 2.1 Luciferase Assay检测转染了PIK3CA质粒后的HeLa细胞中rDNA启动子的活性37
• 2.2 CHIP检测Res调控转染了PIK3CA质粒后的HeLa细胞中RPA194的活性37-38
• 2.3 Realtime-PCR检测转染了PIK3CA质粒的HeLa细胞中pre-rRNA的水平38
• 2.4 Western Blotting技术检测转染了PIK3CA质粒的HeLa细胞中UBF和Akt的表达及其活化水平38-39
• 3 结果39-41
• 3.1 Luciferase Assay检测转染了PIK3CA质粒后的HeLa细胞中rDNA启动子的活性39
• 3.2 Chromatin Immunoprecipitation(CHIP)检测Res调控RNA聚合酶I亚基RPA194的活性39-40
• 3.3 Realtime-PCR检测转染了PIK3CA质粒的HeLa细胞中pre-rRNA的水平40
• 3.4 Western Blotting技术检测转染了PIK3CA质粒的HeLa细胞中UBF和Akt的表达及其活化水平40-41
• 4 讨论41-42
• 结语42-44
• 参考文献44-47
• 附录47-63
• 致谢63

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