TMQ诱导C57/BL6J小鼠NTDs模型的建立及叶酸紊乱对胚胎全基因组甲基化的影响
发布时间：2021-12-18 01:58
研究目的：利用三甲曲沙（Trimetrexate,TMQ）诱导建立C57BL/6J小鼠胚胎神经管畸形（neuraltube defects,NTDs）动物模型；应用全基因组甲基化芯片检测NTDs胎鼠基因组甲基化水平是否发生改变；探讨相关基因甲基化水平改变与NTDs产生的关系。研究方法：将7～8周健康雌性C57BL/6J小鼠随机分组受孕，实验组利用TMQ于孕7.5（E7.5）天腹腔注射一次，建立神经管畸形动物模型，对照组按体重注射生理盐水。在E11.5天时，颈椎脱臼处死正常及NTDs孕鼠；经HE染色后，光镜下观察NTDs发生及神经管闭合情况；测定E7.5天胚胎组织的二氢叶酸还原酶（DHFR）活性；应用全基因组甲基化芯片筛选出甲基化的基因，并对这些差异表达基因进行生物信息学分析，用RT-PCR对差异基因进行表达分析。研究结果：1.经HE染色电镜观察后我们发现TMQ（8mg/kg）诱导对小鼠的胚胎NTD发生率最高，胎鼠后脑泡未闭合。TMQ可致使孕鼠子宫明显肿胀、变形、淤血，可从大体外观判断吸收胎、胎鼠发育迟缓及NTDs的形态表现。2.与对照组相比，胚胎组织中DHFR活性注射三甲曲沙后在4～8...
【文章来源】：山西医科大学山西省
【文章页数】：57 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
TMQ引起的各种发育异常胚胎
常和 NTDs 小鼠胚胎神经管 H&E 染色。A 图是正常和 NTDs 小鼠胚胎端脑的病理结果；B NTDs 小鼠胚胎后脑的病理结果。从左至右放大倍数分别为 20×、50×、200×、400×。论在前期的研究工作中发现，通过使用二氢叶酸还原酶抑制剂诱导产生 NTDs 的型致畸效果稳定，但前期研究中二氢叶酸还原酶抑制剂对于小鼠胚胎致畸作用了解清晰，MTX 通过竞争性的抑制二氢叶酸还原酶的活性，可以阻碍了叶酸的模拟出了与人 NTDs 发病机制相近的动物模型，而 MTX 诱导产生的 NTDs 与 NTDs 是否有差异仍需验证。本研究在同组研究的基础上采用二氢叶酸还原酶曲沙进行验证，成功的诱导出 NTDs 的小鼠动物模型。二氢叶酸不能被还原成氢叶酸，从而阻碍了叶酸代谢通路，叶酸代谢通路的抑制还影响了一碳单位代谢DNA 和组蛋白的甲基化，影响基因的正常表达，同时也干扰了蛋白质和脂类的研究指出，DNA 的高甲基化及低甲基化水平都与染色质结构的异常有关，引起稳定，这提示我们，是否是因为甲基化水平的异常导致了 DNA 二级结构发生
图 1 DNA 质检电泳图。A 图为酶切之前的电泳图。B 图为对片段化后的 DNA（Input）和免甲基化后的 DNA（IP）凝胶电泳结果。在甲基化芯片的结果中会出现以下实验结果报告。Raw data：这个结果包括每个探针的荧光信号强度的原始值。ratio.gff 文件：包括每个探针的 log2（MeDIP/Input）。Signalmap 软件可以导入件直观的显示每个探针的 log2ratio（图 2 绿线）。ratio_peak_pvalues.gff 文件：Peak 的 P-value 用修正的 KS 检验算法计算，它可筛选出的 peak 探针是否比其他区域的探针 log2ratio 更具有阳性的统计学意义。P-小，表示这个探针越有可能代表一个甲基化事件。此文件可以导入 Signalmap 软件红线）。ratio_peak.gff 文件：这个结果来自于 ratio_peak_pvalues.gff 文件。NimbleScan据探针数=2；-log10P-value 2；peak 长度 500bp，筛选出 peak。Peak 代表可能的甲域。此文件可以导入 Signalmap 软件（图 2 蓝线）。基因注释文件：包括可能的 peak 的染色体定位信息以及 peak 周围的基因和 C
【参考文献】：
期刊论文
[1]中国神经管畸形高低发地区季节及性别分布特征[J]. 裴丽君,李竹,李松,洪世欣,叶荣伟,陈新,郑俊池,王太梅,赵秀琴,肖岚,王丽娜,张伯兰,刘志欣,周永兰,姜梅芳,孙霞美,陈海兰,李敏,杨晓玲,沈泉珍,邵佩云,谢连云. 中华流行病学杂志. 2003(06)
[2]中国妇女妊娠前后单纯服用叶酸对神经管畸形的预防效果[J]. 李竹,RobertJ Berry,李松,J David Erickson,王红,Cynthia A Moore,赵平,Joseph Mulinare,洪世欣,LeeYangCWong,呼和牧人,Jacqueline Gindler,郝玲,Adolfo Correa,朱慧萍,Elaine Gunter. 中华医学杂志. 2000(07)
本文编号：3541402
【文章来源】：山西医科大学山西省
【文章页数】：57 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
TMQ引起的各种发育异常胚胎
常和 NTDs 小鼠胚胎神经管 H&E 染色。A 图是正常和 NTDs 小鼠胚胎端脑的病理结果；B NTDs 小鼠胚胎后脑的病理结果。从左至右放大倍数分别为 20×、50×、200×、400×。论在前期的研究工作中发现，通过使用二氢叶酸还原酶抑制剂诱导产生 NTDs 的型致畸效果稳定，但前期研究中二氢叶酸还原酶抑制剂对于小鼠胚胎致畸作用了解清晰，MTX 通过竞争性的抑制二氢叶酸还原酶的活性，可以阻碍了叶酸的模拟出了与人 NTDs 发病机制相近的动物模型，而 MTX 诱导产生的 NTDs 与 NTDs 是否有差异仍需验证。本研究在同组研究的基础上采用二氢叶酸还原酶曲沙进行验证，成功的诱导出 NTDs 的小鼠动物模型。二氢叶酸不能被还原成氢叶酸，从而阻碍了叶酸代谢通路，叶酸代谢通路的抑制还影响了一碳单位代谢DNA 和组蛋白的甲基化，影响基因的正常表达，同时也干扰了蛋白质和脂类的研究指出，DNA 的高甲基化及低甲基化水平都与染色质结构的异常有关，引起稳定，这提示我们，是否是因为甲基化水平的异常导致了 DNA 二级结构发生
图 1 DNA 质检电泳图。A 图为酶切之前的电泳图。B 图为对片段化后的 DNA（Input）和免甲基化后的 DNA（IP）凝胶电泳结果。在甲基化芯片的结果中会出现以下实验结果报告。Raw data：这个结果包括每个探针的荧光信号强度的原始值。ratio.gff 文件：包括每个探针的 log2（MeDIP/Input）。Signalmap 软件可以导入件直观的显示每个探针的 log2ratio（图 2 绿线）。ratio_peak_pvalues.gff 文件：Peak 的 P-value 用修正的 KS 检验算法计算，它可筛选出的 peak 探针是否比其他区域的探针 log2ratio 更具有阳性的统计学意义。P-小，表示这个探针越有可能代表一个甲基化事件。此文件可以导入 Signalmap 软件红线）。ratio_peak.gff 文件：这个结果来自于 ratio_peak_pvalues.gff 文件。NimbleScan据探针数=2；-log10P-value 2；peak 长度 500bp，筛选出 peak。Peak 代表可能的甲域。此文件可以导入 Signalmap 软件（图 2 蓝线）。基因注释文件：包括可能的 peak 的染色体定位信息以及 peak 周围的基因和 C
【参考文献】：
期刊论文
[1]中国神经管畸形高低发地区季节及性别分布特征[J]. 裴丽君,李竹,李松,洪世欣,叶荣伟,陈新,郑俊池,王太梅,赵秀琴,肖岚,王丽娜,张伯兰,刘志欣,周永兰,姜梅芳,孙霞美,陈海兰,李敏,杨晓玲,沈泉珍,邵佩云,谢连云. 中华流行病学杂志. 2003(06)
[2]中国妇女妊娠前后单纯服用叶酸对神经管畸形的预防效果[J]. 李竹,RobertJ Berry,李松,J David Erickson,王红,Cynthia A Moore,赵平,Joseph Mulinare,洪世欣,LeeYangCWong,呼和牧人,Jacqueline Gindler,郝玲,Adolfo Correa,朱慧萍,Elaine Gunter. 中华医学杂志. 2000(07)
本文编号：3541402
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