慢病毒介导的hTERT-shRNA联合光动力治疗对宫颈癌细胞SiHa的影响

发布时间：2017-05-14 17:14

  本文关键词：慢病毒介导的hTERT-shRNA联合光动力治疗对宫颈癌细胞SiHa的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景：宫颈癌是全球女性最常见的生殖道恶性肿瘤之一,其发病率在发展中国家居首位,仅次于乳腺癌的发生。高危型人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)持续感染是宫颈癌发生的主要病因,从宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia, CIN)发展至浸润型宫颈癌是个连续发展的过程,大约经历10年左右。近年来,由于宫颈液基细胞学的应用以及宫颈癌筛查的广泛普及,使得宫颈癌在癌前病变阶段就被识别,宫颈癌的发病率和死亡率有所下降。传统的治疗方法包括放疗、化疗和手术治。光动力治疗(photodynamic therapy,PDT)是肿瘤治疗的一种新模式,通过光敏剂在病变组织中集聚,然后给予特定波长的激光照射后,释放大量的活性氧(ROS),从而破环肿瘤组织。四甲基吡啶卟啉[meso-5,10,15,20-Tetrakis-(N-methyl-4-pyridyl) porphine, TMPyP4]是一种人工合成的新型水溶性光敏剂,为四价阳离子卟啉化合物,进入细胞后可以定位于细胞核,结合并稳定端粒序列上的G-四联体结构,从而抑制端粒酶活性。人端粒酶逆转录酶的组成部分(hTERT)作为端粒酶的活性成分,以自身的RNA为模板合成端粒重复序列,进而维持端粒长度,维持染色体的稳定性。本研究旨在利用慢病毒作为载体将Lenti-hTERT-shRNA稳定转染至正常的和接受TMPyP4-PDT的宫颈癌SiHa细胞株,旨在观察hTERT在宫颈癌的光动力治疗中的作用和可能的机制,为宫颈癌的临床治疗提供一种新的辅助治疗手段。目的：探讨hTERT基因干扰对宫颈癌SiHa细胞株的凋亡、侵袭能力的影响及其在TMPyP4-PDT治疗中的可能机制。方法：利用免疫荧光技术确定最适感染复数(MOI)值,利用PCR和免疫荧光(IF)技术对hTERT基因的干扰序列进行筛选,筛选出干扰效率最高的shRNA序列,并在体外转染宫颈癌SiHa细胞系,用于后续实验。选择宫颈癌SiHa细胞系,实验分为4组：空白对照组、单纯基因治疗组(转染Lenti-hTERT-shRNA)、单纯TMPyP4-PDT组、联合治疗组。CCK-8法检测各处理组的细胞增殖活性；AnnexinV-PE/7-AAD双染试剂盒检测各组细胞的凋亡率；Transwell试验检测各组细胞侵袭能力的改变;RT-PCR法检测Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-8 mRNA的表达；Western Blot检测Bcl-2, Bax, Caspase-3, Caspase-8基因蛋白水平的表达。结果：最适感染复数(MOI)值为20,在4个干扰片段sh-1515、sh-1693、sh-1788、sh-1135中,sh-1693的转染效率最高,用于后续实验。CCK-8结果示：空白对照组、单纯基因治疗组、单纯光动力治疗组、联合治疗组的细胞存活率依次为(1.0±0.03)%、(0.75±0.02)%、(0.62±0.05)%、(0.19±0.03)%。联合治疗组的早期/总凋亡率明显高于其他3组,差异具有统计学意义(P0.05)。Transwell实验结果显示：联合治疗组与单纯基因治疗组和单纯光动力治疗组相比,穿膜细胞数明显减少且差异有统计学意义(P0.05)。RT-PCR结果示：与单纯基因治疗组和单纯光动力治疗组相比,联合治疗组中基因Bcl-2、Caspase-8 mRNA的表达下降,Bex、Caspase-3 mRNA的表达升高,差异有统计学意义(P0.05)。Western Blot结果示：Bcl-2、Caspase-8蛋白表达水平降低,Bax、Caspase-3蛋白表达水平升高。结论：下调hTERT基因通过降低靶基因Bcl-2、Caspase-8的表达和增加Bax、 Caspase-3的表达,在宫颈癌的TMPyP4-PDT中起到诱导肿瘤细胞凋亡、抑制其增值能力和侵袭能力的作用。
【关键词】：宫颈肿瘤 SiHa细胞 人端粒酶逆转录酶 光动力治疗 四甲基吡啶卟啉
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.33
【目录】：

• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-10
• 符号说明10-11
• 前言11-13
• 材料与方法13-27
• 结果27-29
• 讨论29-35
• 结论35-36
• 附图36-39
• 参考文献39-44
• 致谢44-45
• 攻读硕士学位期间发表文章45-46
• 附件46

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 王虎;蔡定芳;;Ca~(2+)与内质网途径的细胞凋亡[J];国际病理科学与临床杂志;2006年04期

2 蔡艳玲;罗小玲;葛连英;刘爱群;谢裕安;;RNAi沉默hTERT基因诱导大肠癌SW480细胞凋亡[J];中国肿瘤生物治疗杂志;2011年01期

  本文关键词：慢病毒介导的hTERT-shRNA联合光动力治疗对宫颈癌细胞SiHa的影响，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：365770