定点编辑人jmjd3基因的TALEN质粒构建及jmjd3基因敲除对人宫颈癌细胞体外效应观察

发布时间：2017-05-16 01:02

  本文关键词：定点编辑人jmjd3基因的TALEN质粒构建及jmjd3基因敲除对人宫颈癌细胞体外效应观察，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:利用TALEN技术构建编辑人jmjd3基因的TALEN质粒,并观察Jmjd3敲除后人宫颈癌细胞体外生长情况。方法:构建编辑人jmjd3基因的TALEN质粒载体(TALEN左臂质粒L1及TALEN右臂质粒R1),经酶切鉴定,测序验证;用TALEN左臂L1、TALEN右臂R1、EGFP荧光质粒共同转染人宫颈癌细胞系Hela,同时设未转染的宫颈癌细胞为空白对照,转染24小时后计算转染效率。随后采用浓度为2ug/ul嘌呤霉素溶液进行筛选至空白对照组细胞全部死亡(3d),共转染组细胞继续培养,行RT-PCR检测宫颈癌细胞内jmjd3 m RNA表达水平,MTT检测细胞增殖活力。结果:经酶切鉴定,DNA测序及blast比对分析证实成功构建编辑人jmjd3基因TALEN质粒对;转染后Hela细胞与空白对照组相比,可见质粒共转染组jmjd3m RNA表达水平明显降低,表达抑制率为(46.5±2.0)%;MTT检测表明质粒共转染组细胞增殖能力明显受到抑制,差异具有统计学意义(P0.05)。结论:1、针对人jmjd3基因位点人工构建的TALEN质粒,可实现对人基因组jmjd3基因位点的编辑。2、编辑jmjd3基因可使宫颈癌细胞系Hela细胞增殖能力明显受到抑制,说明jmjd3参与宫颈癌细胞增殖调控。
【关键词】：TALEN jmjd3 基因编辑 宫颈癌 细胞增殖
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.33
【目录】：

• 摘要3-4
• ABSTRACT4-8
• 中英文缩略词表8-9
• 第1章 前言9-12
• 第2章 材料与方法12-32
• 2.1 菌种12
• 2.2 质粒12
• 2.3 细胞株12
• 2.4 常用软件12
• 2.5 主要仪器12-13
• 2.6 主要试剂13-15
• 2.6.1 质粒构建及鉴定主要试剂13-14
• 2.6.2 细胞培养及转染主要试剂14
• 2.6.3 RT-PCR实验主要试剂14
• 2.6.4 MTT实验主要试剂14-15
• 2.7 主要试剂的配制15-16
• 2.7.1 细胞培养主要试剂的配制15
• 2.7.2 RT-PCR实验主要试剂配制15
• 2.7.3 MTT主要试剂配置15
• 2.7.4 大肠杆菌培养主要试剂配置15-16
• 2.8 TALEN质粒的构建与测序16-22
• 2.8.1 TALEN质粒的设计与合成16-19
• 2.8.2 TALEN质粒的转化19
• 2.8.3 TALEN质粒单克隆的挑取和培养19-20
• 2.8.4 TALEN载体鉴定20-21
• 2.8.5 TALEN表达载体的测序验证21-22
• 2.9 TALEN质粒的编辑效应检测22-31
• 2.9.1 TALEN质粒转染Hela细胞及药物筛选22-27
• 2.9.2 RT-PCR检测jmjd3 mRNA表达水平27-30
• 2.9.3 MTT检测细胞体外增殖情况30-31
• 2.10 统计学处理31-32
• 第3章 结果32-43
• 3.1 编辑人JMJD3 TALEN质粒的构建32-33
• 3.2 编辑人JMJD3 TALEN质粒酶切鉴定33-34
• 3.3 编辑人JMJD3 TALEN质粒测序34-35
• 3.4 编辑人JMJD3 TALEN质粒BLAST比对分析35-39
• 3.5 编辑人JMJD3 TALEN质粒电泳鉴定39
• 3.6 质粒转染效率检测39-40
• 3.7 药物筛选后细胞数对比40
• 3.8 HELA细胞总RNA电泳结果40-41
• 3.9 编辑JMJD3 后HELA细胞MRNA表达情况41
• 3.10 编辑JMJD3 后HELA细胞增殖情况分析41-43
• 第4章 讨论43-46
• 第5章 结论与展望46-47
• 致谢47-48
• 参考文献48-51
• 附图51-52
• 攻读学位期间的研究成果52-53
• 综述53-64
• 参考文献60-64

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

1 Juan Xu;Bo Yu;Christine Hong;Cun-Yu Wang;;KDM6B epigenetically regulates odontogenic differentiation of dental mesenchymal stem cells[J];International Journal of Oral Science;2013年04期

2 ;Efficient and Specific Modifications of the Drosophila Genome by Means of an Easy TALEN Strategy[J];遗传学报;2012年05期

3 夏梦;刘书逊;;Jmjd3-IRF4调控M2型巨噬细胞分化及抗寄生虫感染[J];中国肿瘤生物治疗杂志;2010年06期

4 郭晓强;马克世;;组蛋白去甲基化酶JMJD家族的特点和功能[J];生命的化学;2008年03期

  本文关键词：定点编辑人jmjd3基因的TALEN质粒构建及jmjd3基因敲除对人宫颈癌细胞体外效应观察，由笔耕文化传播整理发布。

，

本文编号：369241