恩度对顺铂耐药卵巢癌肿瘤血管生成及正常化的实验研究

发布时间：2017-05-17 06:14

  本文关键词：恩度对顺铂耐药卵巢癌肿瘤血管生成及正常化的实验研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的卵巢癌因其早期即可发生盆腔、腹腔内种植转移及淋巴结转移,临床症状不明显,发病机制复杂,恶性程度高等原因,死亡率一直居于妇科肿瘤之首,严重威胁妇女的生命健康。尽管治疗上经历了手术及放化疗,但复发率却高达60%,且复发后大部分患者对作为一线化疗药物的顺铂产生耐药,致使预后极差。因此有必要寻找一种新的有效的治疗方法,全面提高卵巢癌患者的总体生存率,改善患者的生活质量。卵巢上皮性癌同其他各种实体瘤一样,其生长为血管依赖性的。肿瘤的发展依靠新生血管为其供应养料和氧气,同时又通过新生血管不断向四周及远处运送肿瘤细胞,致使肿瘤转移。于是,如果能有效的抑制新生血管的生成,就可以达到抑制肿瘤发展及转移的目的。肿瘤血管结构的异常也会导致血管功能的异常。肿瘤血管由于具有不完整性,可导致血流紊乱,无效循环增加,肿瘤血流在时间及空间上形成异质性,最终引起的肿瘤血流的动态变化可直接影响肿瘤微环境的代谢,主要表现为缺氧和酸中毒。而低pH及酸中毒互为因果,不断加剧,最终导致化疗药物输送的减少及放疗抵抗。所以,能否使异常的肿瘤血管趋近正常,继而可以更有效的将氧气及药物输送到肿瘤细胞,进而提高治疗效果?恩度是一种可溶性的抗血管生成的新式抑制剂,能选择性的抑制血管内皮细胞的增殖、迁移及血管构成。已有研究阐明,抗血管生成药物可使肿瘤血管呈现暂时的正常化。本研究实验分为两部分：一、通过观察恩度对SKOV3/DDP肿瘤细胞上清液诱导的HUVECs增殖、迁移及成管的作用,探讨恩度对卵巢癌肿瘤新生血管的影响；二、在成功建立的卵巢癌裸小鼠原位移植模型上观察恩度使肿瘤血管“正常化”的时间窗。方法第一部分：SKOV3/DDP肿瘤细胞上清液的制备：培养SKOV3/DDP细胞,当其融汇度至70%～80%时,换以无血清RPMI-1640培养基,继续培养24h,离心收集上清,将其与含10%FBS的RPMI-1640培养基以1：4混合备用。MTT法观察恩度浓度为10-7,10-4,10-5,10-4,10-3,10-2及10-1mg/ml时,药物对SKOV3/DDP月中瘤细胞上清液诱导的HUVECs增殖作用的影响。时间设定为24h,48h,72h三个点。细胞划痕实验观察恩度对SK0V3/DDP,肿瘤细胞上清液诱导过的HUVECs迁移的影响。细胞在6孔板中融合度达到90%后,用20p 1的枪头垂直划痕,用1×PBS冲洗漂浮细胞。设定恩度浓度为10-6,10-4,10-2mg/ml,继续于无血清RMPI-1640培养基中孵育6小时后,直接在倒置相差显微镜下拍照。使用ImageJ软件测量两端细胞的间距,计算迁移率,绘制图表,用SPSS18.0进行统计学分析,比较各组迁移情况。成管实验观察恩度对SK0V3/DDP肿瘤细胞上清液诱导过的HUVECs在血管形成中的影响。待Matrigel完全呈流动液态后铺96孔板,每孔50u 1,置于37-C培养箱放置30min使之凝固。计数调节HUVECs细胞至1×105个/ml,设立对照孔,使恩度终浓度分别为10-6,10-4,10-2mg/ml,37℃恒温箱中继续孵育4h后于倒置显微镜下察看血管形成情况并拍照。使用ImageJ软件测量细胞成管的长度,计算在不同浓度恩度作用下HUVECs的成管率,绘制图表,用SPSS18.0进行统计学分析,比较各组管腔形成情况。第二部分：MTT法明确SK0V3/DDP细胞对顺铂的耐药性。设定培养板中顺铂的浓度分别为0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8μg/ml,在恒温培养箱中孵育48h后,用全自动酶标仪选择490nm的波长检测出溶液吸光值,记录分析数据,并绘制出不同药物浓度下的细胞存活生长曲线。裸小鼠卵巢原位移植模型使用SK0V3/DDP细胞系。建立卵巢癌模型时,先将计数后的SK0V3/DDP细胞注射到雌性裸小鼠颈部皮下,待皮下瘤直径1cm后将小鼠拖颈处死,超净台内将皮下瘤取出切成小块,而后将小块瘤组织植入剩余雌性裸小鼠左侧卵巢内,持续追踪观察原位移植肿瘤在裸小鼠卵巢内的生长状况。当腹部可扪及肿块时将荷瘤鼠处死,解剖并取出原位移植处的肿瘤,与正常裸小鼠卵巢组织及皮下肿瘤组织均做病理切片,HE染色后进行观察。确定模型构建成功后,将30只满足实验要求的裸小鼠原位移植模型随机分为6组,每组5只：其中3组每次腹腔注射恩度10mg/kg,一次注射量均为0.2ml,在第3、6、9天分别各处死一组,对照组为剩余3组,每日腹腔内注射生理盐水0.2ml,在对应时间内处死。恩度处理不同时间后,用CD31染色检测肿瘤血管内皮细胞完整性。ImageJ软件进行完整血管的计数,被抗体染色的细胞,要形成一个完整的管腔结构才认为是一个可计数的血管。结果一部分：不同浓度的恩度(10-1,10-6,10-5,10-4,10-3,10-2,10-1mg/ml)分别处理HUVECs细胞24h,48h,72h后,对细胞增殖无明显影响,各组间存活率无统计学差异。恩度给药组划痕区间距相较对照组大,两两比较均有统计学差异(P0.05)。而不同浓度药物对HUVECs细胞迁移作用未有明显差异,差异无统计学意义(P0.05)。对照组及实验组均有管腔形成,分布均匀,镜下未见明显差异,用ImageJ图像分析软件计算细胞成管长度后发现,对照组及实验组差异不明显,无统计学意义(P0.05)。二部分：顺铂对SK0V3/DDP及SK0V3细胞的IC50分别为(11.647±1.078)μg/ml和(2.486±0.983)u g/ml,表明人卵巢浆液性乳头状囊腺癌细胞耐药株较敏感株而言,对顺铂的作用不明显,差异有统计学意义(F=2.386,P0.05)。荷瘤裸小鼠在处死后剖腹探查时可见原位移植处局部有癌肿包块形成,与周围组织有粘连,病理切片显示原位瘤块具有癌细胞的明显特征。3、6、9天对照组肿瘤血管结构紊乱迂曲、管径不一,且分支多,绝大多数外周被覆不完整的内皮细胞。而恩度给药3天及9天的血管完整性增加(23%±4.58%,17.67%±8.34%,P0.05),分支较少；特别是给药6天后发现,血管管壁完整,直径均匀,完整性明显增加(75.33%±8.02%,P0.O1VS3天及9天)。结论一部分：恩度对SK0V3/DDP肿瘤细胞上清液诱导的HUVECs增殖及管腔形成无明显作用,对细胞迁移作用欠佳。二部分：成功的利用SK0V3/DDP肿瘤细胞建立了裸小鼠卵巢原位移植移植模型。基于模型基础上给药后发现,恩度能够在治疗第6天时使耐药性卵巢癌肿瘤血管产生一个明显的正常化“时间窗”,该时期较为短暂,但完整性极佳。
【关键词】：恩度 顺铂耐药性卵巢癌 肿瘤血管正常化
【学位授予单位】：长江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.31
【目录】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-11
• 英文符号缩写词表11-13
• 第一部分 恩度对肿瘤上清液诱导的HUVECs增殖、迁移及成管的影响13-25
• 引言13-14
• 第一节 实验材料及方法14-19
• 第二节 实验结果19-22
• 第三节 讨论22-25
• 第二部分 恩度使肿瘤血管“正常化”时间窗的观察25-37
• 引言25-26
• 第一节 实验材料及方法26-31
• 第二节 实验结果31-34
• 第三节 讨论34-37
• 参考文献37-41
• 综述41-49
• 参考文献45-49
• 致谢49-50
• 个人简介50-51

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本文编号：372704