赖氨酸特异性去甲基化酶1在卵巢癌细胞增殖和凋亡中作用的研究
本文关键词：赖氨酸特异性去甲基化酶1在卵巢癌细胞增殖和凋亡中作用的研究，由笔耕文化传播整理发布。
【摘要】：背景和目的:赖氨酸特异性去甲基化酶1(lysine-specific demethylase 1,LSD1)是2004年发现的一种黄素腺嘌呤二核苷酸(Flavin adenine dinulcleotide,FAD)依赖性胺氧化酶,它能通过氧化反应生成甲醛而特异性去除组蛋白H3第4位赖氨酸(H3K4)和第9位赖氨酸(H3K9)的甲基化修饰,调控着基因转录的激活与抑制,发挥重要的生物学功能。最近的研究显示LSD1在肿瘤的发生、发展、增殖及迁移侵袭中扮演重要的角色。目前已有研究报道LSD1在卵巢癌组织和细胞株中高度表达,而与卵巢癌细胞增殖关系尚不明确。因此,本研究以卵巢癌细胞HO8910为研究对象,探索LSD1基因过表达、敲低及其酶活性抑制对HO8910细胞增殖、周期和凋亡的影响,以及对细胞增殖和凋亡相关基因表达的调节作用。方法:1.利用慢病毒载体构建稳定干扰LSD1的卵巢癌HO8910细胞株,首先合成特异性针对LSD1基因的shRNA,插入pLKO-Tet-On载体,构建重组慢病毒质粒p LKO-Tet-On-shLSD1;然后将pLKO-Tet-On-shLSD1、pHR’-CMV-8.2ΔVPR和pHR’-CMV-VSVG三种质粒共转染293T细胞,转染试剂采用Lipofectamine2000包装产生慢病毒;再将携带有LSD1-shRNA的慢病毒感染HO8910细胞,采用嘌呤霉素筛选LSD1-shRNA稳定转入的HO8910细胞。2.构建稳定过表达LSD1的卵巢癌细胞株,首先用Lipofectamine2000将pLVX-Tet-On、pHR’-CMV-8.2ΔVPR及pHR’-CMV-VSVG三种质粒共转染293T细胞,收集病毒上清感染HO8910细胞,采用G418筛选细胞得到稳定的HO8910-rtTA细胞;再用包含p LVX-tight-puro-LSD1的慢病毒颗粒感染HO8910-rtTA细胞,用嘌呤霉素筛选细胞得到稳定转染过表达LSD1细胞株。3.用实时定量RT-PCR和Western blot法分别检测LSD1干扰(LSD1-knockdown,LSD1-KD)和过表达(LSD1-overexpression,LSD1-OE)的HO8910细胞中LSD1 mRNA和蛋白的表达及其底物H3K4me2表达水平。4.利用不同浓度(0、25、50、100μmol/L)LSD1特异性抑制剂tranylcypromine(TCP)处理HO8910细胞,采用MTT法和EdU DNA标记法检测细胞的增殖;在LSD1-KD和LSD1-OE HO8910细胞中,加入不同浓度(0、1、10、100 ng/m L)doxycycline(Dox)诱导LSD1敲低或过表达后,检测细胞增殖的变化。5.采用Annexin V/PI和流式细胞仪分别检测上述不同处理组中细胞凋亡和细胞周期的变化。6.利用Western blot法检测不同处理组细胞中P21、Bax、Bcl-2和Survivin蛋白的表达水平。结果:成功建立了稳定干扰LSD1和过表达LSD1的卵巢癌HO8910细胞株;干扰LSD1基因表达或抑制LSD1酶活性,能够显著抑制HO8910细胞的增殖和促进细胞的凋亡(P㩳0.05);而LSD1过量表达,则显著促进HO8910细胞的增殖及抑制细胞的凋亡。此外,LSD1表达下调诱导细胞周期阻滞在G1期,并下调促存活蛋白Bcl-2和Survivin的表达,以及上调促凋亡蛋白P21和Bax表达;相反,外源性表达LSD1能够促进HO8910细胞G1/S期转化,并上调Bcl-2和Survivin蛋白的表达水平,以及下调P21和Bax蛋白的表达。结论:抑制及干扰人卵巢癌HO8910细胞的LSD1能有效抑制细胞的生长和增殖,使细胞阻滞在G1期,促进细胞凋亡;而外源性表达LSD1能够增强细胞的增殖,促进细胞G1/S期转化,抑制细胞的凋亡。我们的研究结果提示,LSD1可能是卵巢癌治疗新的靶点。
【关键词】：卵巢癌 LSD1 细胞增殖 细胞凋亡 基因表达
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.31
【目录】：
- 中文摘要5-7
- ABSTRACT7-13
- 主要英文缩写与名词对照13-15
- 第一章 前言15-25
- 1.1 卵巢癌15-16
- 1.1.1 卵巢癌流行趋势15
- 1.1.2 卵巢癌中的表观遗传修饰15-16
- 1.2 LSD116-22
- 1.2.1 LSD1基本结构16-17
- 1.2.2 LSD1催化机理17-18
- 1.2.3 LSD1的调控18-19
- 1.2.4 LSD1与肿瘤的关系19-22
- 1.3 研究内容22-25
- 1.3.1 研究目的和意义22
- 1.3.2 实验设计思路22-25
- 第二章 建立LSD1稳定表达的卵巢癌细胞株25-45
- 2.1 实验仪器和材料25-30
- 2.1.1 实验仪器25-26
- 2.1.2 主要耗材26
- 2.1.3 主要试剂26-27
- 2.1.4 配制的试剂27-30
- 2.2 实验方法30-40
- 2.2.1 293T细胞及H08910细胞的复苏、传代及冻存30-31
- 2.2.2 药物浓度筛选31
- 2.2.3 构建稳定干扰LSD1的卵巢癌HO8910细胞株31-33
- 2.2.4 构建稳定过表达LSD1的卵巢癌HO8910细胞株33-34
- 2.2.5 Western blot法检测LSD1蛋白的表达34-36
- 2.2.6 定量RT-PCR检测LSD1 mRNA的表达36-38
- 2.2.7 稳定诱导的细胞H3K4me2的表达水平38-40
- 2.2.8 数据统计分析40
- 2.3 结果40-43
- 2.3.1 成功构建稳定干扰LSD1的卵巢癌HO8910细胞株40-41
- 2.3.2 成功构建过表达LSD1的卵巢癌细胞HO8910细胞株41-42
- 2.3.3 改变LSD1表达对H3K4me2表达的影响42-43
- 2.4 讨论43-45
- 第三章 LSD1对卵巢癌细胞增殖的影响45-56
- 3.1 实验仪器和材料45-46
- 3.1.1 实验仪器45
- 3.1.2 主要耗材45
- 3.1.3 主要试剂45
- 3.1.4 配置的试剂45-46
- 3.2 实验方法46-49
- 3.2.1 卵巢癌细胞培养及保存46-47
- 3.2.2 MTT法检测细胞增殖47
- 3.2.3 Cell-LightTM EdUTP TUNEL (EdU) 染色法47-48
- 3.2.4 数据统计分析48-49
- 3.3 结果49-54
- 3.3.1 MTT实验结果49-51
- 3.3.2 EdU实验结果51-54
- 3.4 讨论54-56
- 第四章 LSD1对卵巢癌细胞周期的影响56-61
- 4.1 实验仪器和材料56
- 4.1.1 实验仪器56
- 4.1.2 主要耗材56
- 4.1.3 主要试剂56
- 4.1.4 配置的试剂56
- 4.2 实验方法56-58
- 4.2.1 检测原理56-57
- 4.2.2 碘化丙啶（PI）单染色法步骤57-58
- 4.2.3 数据统计分析58
- 4.3 结果58-60
- 4.4 讨论60-61
- 第五章 LSD1对卵巢癌细胞凋亡的影响61-67
- 5.1 实验仪器和材料材料61
- 5.1.1 实验仪器61
- 5.1.2 主要耗材61
- 5.1.3 主要试剂61
- 5.1.4 配制的试剂61
- 5.2 实验方法61-63
- 5.2.1 检测原理61-62
- 5.2.2 实验步骤62-63
- 5.2.3 数据统计分析63
- 5.3 结果63-66
- 5.4 讨论66-67
- 第六章 LSD1对增殖和凋亡相关基因表达的调节67-72
- 6.1 实验仪器和材料67
- 6.1.1 实验仪器67
- 6.1.2 主要耗材67
- 6.1.3 主要试剂67
- 6.2 实验方法67-68
- 6.2.1 细胞培养及加药处理67
- 6.2.2 免疫印迹法（Western Blot）检测LSD1对增殖和凋亡相关蛋白的表达67-68
- 6.3 结果68-70
- 6.4 讨论70-72
- 第七章 总结和展望72-74
- 参考文献74-81
- 致谢81-82
- 在学期间发表的学术论文及其他科研成果82
- 发表的论文82
- 参加的课题82
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