孕妇B族链球菌感染荧光PCR检测技术的建立和应用

发布时间：2017-05-18 15:24

  本文关键词：孕妇B族链球菌感染荧光PCR检测技术的建立和应用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：[背景]B族链球菌(Group B Streptococcus,GBS)为革兰氏阳性球菌,是围产期和新生儿感染疾病的首要致病菌。GBS按其型的特异性可分为至少10个血清型,任何血清型都能引起早发型GBS感染。已有研究发现,GBS还可引起尿路感染、羊膜炎、产后子宫内膜炎、伤口感染、产时和/或产后菌血症以及死产,生殖道GBS菌落可引起胎膜早破或早产,GBS也已成为新生儿出生后2个月内菌血症和脑膜炎的最常见致病菌。目前的GBS检测方法有:病原分离、革兰氏染色、免疫荧光抗体检测、血清淀粉培养基比色法,检测抗原的多种方法如同协同凝集试验、乳胶凝集试验和酶联免疫吸附试验、以及DNA探针,但血清学方法多存在耗时、耗力、准确率低等缺点,而新发展的快速检测分子生物学的常规方法在某些方面可以弥补血清学的不足,但是环境污染、重复性不高、灵敏度不足、假阳性等限制了推广应用。[目的]建立合理检测方法,快速检测孕妇感染的B族链球菌。[研究方法]本研究采用了实时荧光PCR扩增特异性DNA靶片断,使用荧光标记的杂交探针进行检测并实时监测扩增产物。通过对GBS引物探针的验证、最低检出险、线性范围、准确性、特异性、干扰物质、重复性等进行评价,采用荧光PCR法与序列分析法同时对样本进行检测,综合各种检测方法检测结果,对荧光PCR法试剂进行灵敏度、特异性、总符合率、Kappa值一致性评价及Kappa值的假设检验(U),评价临床考核试验的真实性及可靠性。[结果]结果显示:本反应体系的灵敏度确定为1×104CFU/ml,线性范围为1×108copies/ml—2×103copies/ml,准确率为100%,特异性良好、不存在干扰,精密度参考品变异系数CV均小于5%,重复性符合要求。用建立的方法检测苏州大学附属第一医院200份样本,37份阳性全部检出,163阴性全部为阴性。[结论]通过性能评价试验和临床样本验证,本研究建立的实时定量荧光PCR方法是一种特异性强、灵敏度高,重复性好,快速安全的检测方法,可以用于GBS的快速检测。
【关键词】：B族链球菌 荧光定量PCR 快速检测
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R714.251;R440
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 第一章 引言10-20
• 1.1 B族链球菌生物学10-11
• 1.2 B族链球菌流行病学11-14
• 1.3 B族链球菌临床特征14-16
• 1.4 B族链球菌感染诊断16-19
• 1.5 本研究研究目的和试验设计19-20
• 第二章 实验方法20-29
• 2.1 实验材料20-21
• 2.1.1 临床样本20
• 2.1.2 标准菌株20-21
• 2.1.3 试剂21
• 2.1.4 主要仪器21
• 2.2 荧光PCR法建立21-24
• 2.2.1 引物与探针的设计合成21
• 2.2.2 荧光PCR反应体系21-22
• 2.2.3 最低检出量的评价22
• 2.2.4 线性范围的评价22
• 2.2.5 准确性的评价22-23
• 2.2.6 特异性的评价23
• 2.2.7 干扰物质的评价23
• 2.2.8 重复性评价23
• 2.2.9 核酸提取方法评价23-24
• 2.2.10 稳定性24
• 2.3 荧光PCR法与测序方法的比较24-27
• 2.3.1 测序模板制备24-25
• 2.3.2 表 2.5 B族链球菌Nested PCR反应体系25
• 2.3.3 PCR产物直接送给委托Life公司的测序服务机构进行测序25-26
• 2.3.4 实验方案26-27
• 2.4 统计分析27-29
• 第三章 实验结果29-41
• 3.1 B族链球菌的引物和探针的验证29
• 3.2 最低检出量的评价29-30
• 3.3 线性范围的评价30-31
• 3.4 准确性评价31
• 3.5 特异性评估31-32
• 3.6 干扰物质32-33
• 3.7 重复性评价33-34
• 3.8 核酸提取方法评价34-38
• 3.9 稳定性38-40
• 3.10 200 例临床样本检测结果40-41
• 第四章 结果讨论41-46
• 4.1 GBS感染的危害41
• 4.2 GBS传统检测方法41-42
• 4.3 GBS抗原检测法42-43
• 4.4 本研究建立的液相法为基础的核酸提取系统结合荧光定量PCR检测43-45
• 4.5 本研究结果45-46
• 参考文献46-54
• 攻读学位期间公开发表的论文54-55
• 附录55-58
• 致谢58-59

【引证文献】

中国重要会议论文全文数据库 前1条

1 徐永萍;;B族链球菌感染对母儿的影响(国内外文献研究)B族溶血性链球菌与围产结局及预防[A];第五届环渤海围产医学学术会议暨山东省第四次围产医学学术会议论文汇编[C];2012年

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本文编号：376444