LncRNA在卵巢癌耐药细胞株中的筛选及作用机制的初探

发布时间：2017-05-19 17:29

  本文关键词：LncRNA在卵巢癌耐药细胞株中的筛选及作用机制的初探，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：卵巢恶性肿瘤具有起病隐匿、转移性强、预后较差等特点,是女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一,死亡率位居妇科恶性肿瘤之首,发病率居女性生殖器恶性肿瘤的第二位,仅次于宫颈癌。其发病率约22.9%,并以每年1%的速度递增。在妇科恶性肿瘤中,最为常见的即上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer,EOC),占卵巢癌病例的85-90%。卵巢癌高发年龄在40~70岁间,患者5年生存率约30%。由于临床症状不明显,患者在出现严重腹痛或消化道症状时才就诊,初诊患者中有2/3已属晚期,其中超过70%已有盆腔转移或淋巴转移。对于中晚期卵巢癌患者,化疗是主要的治疗手段之一。目前公认的晚期卵巢癌标准化治疗方案为“肿瘤细胞减灭术联合铂类药物化疗”,例如紫杉醇联合铂类化疗在卵巢癌综合治疗中占有重要地位。其中,顺铂作为被广泛应用的一线化疗药物在众多实体肿瘤中均具明显的抗肿瘤疗效。然而,肿瘤细胞的原发或继发性耐药是影响化疗效果的重要因素,是造成肿瘤复发的主要原因。随着耐药现象的不断出现,顺铂的疗效渐不尽人意。铂类耐药可能由多种机制产生,其成因包括:肿瘤内外环境改变、细胞药物摄入减少、细胞解毒作用增强、DNA损伤修复能力增强、错配修复减少、细胞凋亡通路受阻等。虽然铂类为基础的联合化疗取得了新的进展,但其5年生存率却无明显提高。而其中明确顺铂耐药机制、寻找有效的耐药逆转剂对提高卵巢癌化疗敏感性和调整治疗方案具有重要的意义。与此同时,非编码RNA在疾病发生机制和调控方面的重要性逐渐显露。非编码RNA参与众多复杂疾病发生,例如sn RNA参与自体免疫性疾病如红斑狼疮发生,sno RNA与硬皮病相关等。另外,非编码RNA与肿瘤发生或抑制的相关性也被一再证实,其变化很可能导致细胞异常和癌变。例如,mi R-15和mi R-16起着肿瘤抑制基因的作用,在人慢性淋巴细胞白血病发生过程中发挥重要作用。作为非编码RNA的重要一员,Lnc RNA异常调节参与包括胃癌、肝癌、肺癌等多种肿瘤疾病发生。Lnc RNA表达水平的改变甚至是空间结构变化都可引起一系列蛋白表达和信号变化,是癌症发生发展的基础条件之一。例如,HOTAIR可介导的染色质改变和癌症转移。HOTAIR与PRC2(polycomb repressive complex 2)的互作通过引起染色质的三甲基化状态改变加快癌细胞转移。近年研究发现,长链非编码RNA(long non-coding RNAs,Lnc RNAs)可能与卵巢癌发生发展密切相关。因此,分析寻找与顺铂耐药相关的Lnc RNAs,及深入探讨Lnc RNAs在顺铂治疗耐药过程中的分子机制为卵巢癌的治疗提供新的研究思路。研究拟以卵巢癌细胞A2780(顺铂敏感),CP70(顺铂耐药)为研究对象,采用Lnc RNA及m RNA基因芯片差异分析、实时荧光定量PCR、免疫细胞化学法检测卵巢癌细胞中的Lnc RNA及m RNA基因表达变化,分析其与顺铂耐药之间的关系,寻找与顺铂耐药可能相关的基因。本研究将为寻找参与卵巢癌顺铂耐药基因提供有力的实验依据,并为进一步探讨其在卵巢癌顺铂耐药中的作用机制奠定基础。实验目的:1.观察顺铂敏感细胞株A2780和耐药细胞株CP70的Lnc RNA及m RNA的表达差异;2.分析筛选与顺铂耐药相关的LncRNA;3.研究筛选出的LncRNA参与顺铂耐药的内在机制,为筛选特异Lnc RNA成为逆转卵巢癌顺铂耐药的分子靶点提供理论依据。方法及内容:1.以顺铂敏感细胞株A2780、耐药细胞株CP70为研究对象,应用Lnc RNA基因芯片差异分析、实时荧光定量PCR等观察Lnc RNA在卵巢癌耐药非耐药细胞中的表达变化,分析Lnc RNA基因表达水平变化导致顺铂耐药的分子机制。2.以A2780/CP70细胞为研究对象,应用m RNA基因芯片差异分析、实时荧光定量PCR等观察m RNA在卵巢癌耐药非耐药细胞中的表达变化,分析m RNA基因表达水平变化与顺铂耐药的相关性。3.生物信息学分析比对Lnc RNA基因芯片与m RNA基因芯片差异表达基因,遴选特异的Lnc RNA。4.应用实时荧光定量PCR验证特异的Lnc RNA与m RNA表达水平相关性,分析Lnc RNA在参与顺铂耐药过程中可能的耐药机制。5.以顺铂耐药细胞株CP70为研究对象,应用si RNA技术沉默相关Lnc RNA基因,实时荧光定量PCR观察转染后特异基因的表达,MTT法观察特异Lnc RNA的si RNA对卵巢癌细胞顺铂敏感性的影响,并分析其内在的分子机制。实验结果:1.Lnc RNA基因芯片分析结果显示,Lnc RNA差异表达基因共1902条。CP70相对A2780高表达的Lnc RNA 1033条,CP70相对A2780低表达的Lnc RNA 869条。2倍以上升高共298条;2倍以上降低的共307条;5倍以上升高共14条;5倍以上降低的共11条。2.m RNA差异表达基因共1469条。CP70相对A2780高表达的m RNA 547条,CP70相对A2780低表达的m RNA共922条。2倍以上升高共167条;2倍以上降低的共298条;5倍以上升高共20条;5倍以上降低的共29条。3.实验在相似细胞系SKOV3/SKOV3-DDP中进行Lnc RNA的q PCR二次验证,在RT-PCR的相关实验结果中,我们筛选出可能与顺铂耐药相关的5条Lnc RNA。4.选择在两组卵巢癌耐药细胞系上调均明显的LncRNA,命名为U2,设计并合成其序列特异性si RNA,对CP70顺铂耐药株进行si RNA转染并观察顺铂耐药逆转情况。结果显示,Lnc RNA-U2基因沉默的CP70细胞对顺铂的敏感性有所恢复。5.我们将芯片结果录入数据库并进行了GO(Gene Ontology analysis)富集分析,在信号通路、分子功能、细胞定位方面进行聚类统计。结果发现,变化基因主要定位在细胞膜及细胞核内,行使包括胞间连接、细胞增殖调控的功能。其中,包括Bax/Bcl-2等基因发生表达变化。6.实验分析了Lnc RNA-U2与Bax/Bcl-2的表达相关性,Western-blot发现下调卵巢癌耐药细胞系CP70中的Lnc RNA-U2后,促凋亡蛋白Bax表达上调,凋亡抑制蛋白Bcl-2表达下调,Bax/Bcl-2比例明显提高。结论:1.Lnc RNA参与顺铂耐药的发生,而通过基因芯片筛选和RT-PCR验证后确定Lnc RNA-U2在顺铂耐药转变中发挥重要作用。2.LncRNA-U2促进顺铂耐药的作用可能是通过调控Bax/Bcl-2等细胞凋亡蛋白实现的。
【关键词】：卵巢癌 LncRNA 顺铂耐药 芯片分析
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.31
【目录】：

• 缩略语表5-7
• 中文摘要7-11
• 英文摘要11-14
• 前言14-16
• 文献回顾16-31
• 实验一31-52
• 1 材料31-33
• 1.1 实验试剂31
• 1.2 主要仪器31-32
• 1.3 主要溶液及配制32
• 1.4 细胞及研究对象32-33
• 2 方法33-39
• 2.1 细胞的复苏、传代、保存33-34
• 2.2 细胞总RNA的提取34-35
• 2.3 细胞总RNA的纯化与质量控制35-36
• 2.4 细胞LncRNA/mRNA的基因芯片分析36-38
• 2.5 实时荧光定量PCR检测差异LncRNA的表达38-39
• 2.6 生物信息学分析39
• 3 结果39-49
• 3.1 细胞总RNA的提取及鉴定39-41
• 3.2 LncRNA/mRNA的基因芯片分析结果41-45
• 3.3 RT-PCR引物PCR反应条件检验45-46
• 3.4 显著下调LncRNA的RT-PCR验证46-48
• 3.5 显著上调LncRNA的RT-PCR验证48-49
• 4 讨论49-52
• 实验二52-65
• 1 材料52-55
• 1.1 实验试剂52-53
• 1.2 主要仪器53-54
• 1.3 主要溶液及配制54-55
• 1.4 细胞及研究对象55
• 2 方法55-58
• 2.1 LncRNA-U2 siRNA合成及细胞转染实验55
• 2.2 RT-PCR检测siRNA对LncRNA-U2表达抑制效率55-56
• 2.3 MTT法检测卵巢癌细胞顺铂敏感性逆转实验56
• 2.4 检测U2对细胞迁移活性的影响56-57
• 2.5 western blot检测U2与细胞凋亡蛋白相关性57-58
• 3 结果58-63
• 3.1 siRNA抑制LncRNA效率的检测58
• 3.2 MTT法检测卵巢癌细胞顺铂敏感性逆转58-61
• 3.3 western blot检测LncNA-U2对细胞凋亡信号相关蛋白的表达影响61
• 3.4 检测LncRNA-U2对细胞迁移活性的影响61-63
• 4 讨论63-65
• 小结65-68
• 参考文献68-73
• 附录73-77
• 个人简历和研究成果77-79
• 致谢79

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本文编号：379359