靶向TGF-β1主动免疫调控肿瘤微环境以及核酸与纳米材料佐剂对治疗性HPV疫苗作用的影响

发布时间：2023-09-03 18:16

　　宫颈癌是严重危害女性健康的疾病之一,而人乳头瘤病毒(HPV)的感染是导致宫颈癌的主要因素。虽然目前已经有三种预防性HPV疫苗批准上市,能够保护约90%的HPV感染引起的宫颈癌,但其对已经建立的HPV持续感染、癌前病变及癌症并没有治疗效果。因此,研发有效的治疗性HPV疫苗对于临床治疗HPV相关肿瘤具有重要意义。转化生长因子-β1(TGF-β1)是肿瘤微环境中关键的免疫抑制分子,其能够诱导初始T细胞分化为调节性T细胞(Treg),分化的Treg细胞通过多种机制显著抑制效应T细胞分化、增殖及功能。TGF-β1促进骨髓来源免疫抑制细胞(MDSCs)分化、增殖及向肿瘤迁移。此外,TGF-β 1也可促肿瘤细胞增殖、促肿瘤血管生成、刺激细胞外基质表达等促进肿瘤的生长与转移。除了 Treg细胞,肿瘤微环境中的免疫抑制细胞MDSCs、肿瘤相关巨噬细胞、以及成纤维细胞等都能够表达TGF-β1。因此,靶向TGF-β 1进行干预,具有拮抗肿瘤免疫抑制微环境,促进抗肿瘤免疫的潜力。Toll-样受体(TLR)3/9以及STING激动剂cGAMP显示了强效的诱导Thl/CTLs偏向的细胞免疫应答的能力,是有潜力的肿...

【文章页数】：129 页

【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
前言
    一、HPV的生物学特征及致病机制
    二、HPV治疗性疫苗研究现状
    三、肿瘤微环境的作用机制
    四、TGF-β在肿瘤中的重要作用
    五、抗细胞因子主动免疫策略的应用前景
    六、新型佐剂在提高疫苗作用中的影响
    七、纳米颗粒靶向递送抗原在肿瘤治疗中的重要作用
    八、研究目的及意义
第一部分 靶向TGF-β1主动免疫对HPV16病毒样颗粒治疗性疫苗作用的影响
    1 引言
    2 实验材料与方法
        2.1 实验材料
            2.1.1 质粒、菌株及细胞株
            2.1.2 实验动物
            2.1.3 实验试剂及耗材
        2.2 实验方法
            2.2.1 呈递TGF-β1_67-75的重组表达质粒的构建
            2.2.2 重组质粒的诱导表达
            2.2.3 硫酸铵盐析法初步纯化重组蛋白
            2.2.4 蔗糖密度梯度离心纯化目的蛋白
            2.2.5 Sephadex G25脱盐
            2.2.6 BCA蛋白质定量
            2.2.7 病毒样颗粒鉴定
            2.2.8 肿瘤细胞培养
            2.2.9 小鼠HPV16移植肿瘤模型的建立
            2.2.10 皮下免疫
            2.2.11 靶向抑制TGFβ1并结合HPV16治疗性疫苗对小鼠肿瘤模型干预实验研究
            2.2.12 采血
            2.2.13 小鼠血清IgGI、IgG2a抗体水平检测
            2.2.14 小鼠脾脏及肿瘤组织的获取
            2.2.15 体外分离小鼠脾脏组织淋巴细胞
            2.2.16 体外分离小鼠肿瘤组织淋巴细胞
            2.2.17 ELISA检测脾细胞刺激上清的细胞因子表达
            2.2.18 ELISPOT检测分泌IFN-γ的T细胞的水平
            2.2.19 流式细胞术检测CTL细胞水平
            2.2.20 流式细胞术检测Th1细胞水平
            2.2.21 流式细胞术检测Treg细胞水平
            2.2.22 免疫组化
            2.2.23 肿瘤组织总RNA提取
            2.2.24 肿瘤组织mRNA的逆转录及qPCR检测
            2.2.25 Western Blot
    3 结果与分析
        3.1 HBcAg- TGFβ1_67-75重组质粒的酶切鉴定
        3.2 重组蛋白的纯化
        3.3 病毒样颗粒的鉴定
            3.3.1 病毒样颗粒的HPLC分析
            3.3.2 病毒样颗粒的电镜观察
        3.4 TGFβ1 VLPs联合免疫HPV16治疗性疫苗对小鼠肿瘤模型的干预研究
            3.4.1 HBcAg-TGFβ1_67-75和HBcAg-E7_49-57 VLPs联合免疫对小鼠肿瘤生长的影响
            3.4.2 HBcAg-TGFβ1_67-75和HBcAg-E7_49-57 VLPs联合免疫对IgG1/IgG2a应答偏向性的影响
            3.4.3 HBcAg-TGFβ1_67-75和HBcAg-E7_49-57 VLPs联合免疫对细胞因子应答的影响
            3.4.4 HBcAg-TGFβ1_67-75和HBcAg-E7_49-57 VLPs联合免疫对分泌IFN-γ的淋巴细胞水平的影响
            3.4.5 HBcAg-TGFβ1_67-75和HBcAg-E7_49-57 VLPs联合免疫对脾脏Th1、CTLs效应淋巴细胞水平的影响
            3.4.6 HβcAg-TGFβ1_67-75和HBcAg-E7_49-57 VLPs联合免疫对脾脏组织Treg细胞水平的影响
            3.4.7 HBcAg-TGFβ1_67-75和HBcAg-E7_49-57 VLPs联合免疫对肿瘤组织中E7特异的CTL细胞和Treg细胞的影响
            3.4.8 HBcAg-TGFβ1_67-75和HBcAg-E7_49-57 VLPs联合免疫对肿瘤组织血管生成以及VEGF基因表达的影响
            3.4.9 联合免疫对肿瘤微环境中相关细胞因子以及趋化因子的转录水平的影响
            3.4.10 靶向TGFβ1对肿瘤组织中TGFβ1信号通路激活的影响
    4 讨论
        4.1 疫苗联合疗法是有效的肿瘤干预新手段
        4.2 TGF-β1作为调控靶点并联合治疗性疫苗的潜能及安全性
        4.3 应用VLP作为载体利于打破自身蛋白的免疫耐受
        4.4 靶向TGF-β1并联合VLPs治疗性疫苗对小鼠肿瘤干预潜能
        4.5 联合免疫TGF-β1 VLPs和VLPs治疗性疫苗诱导的免疫效应评价
        4.6 联合免疫对肿瘤血管、相关趋化因子的影响
        4.7 靶向TGF-β的作用机制初步评价
    5 小结
第二部分 核酸免疫刺激物及纳米颗粒佐剂对HPV16 E7抗原激发的抗肿瘤免疫应答的影响
    1 引言
    2 实验材料与方法
        2.1 实验材料
            2.1.1 实验动物
            2.1.2 实验所需抗体
            2.1.3 实验所需主要耗材
            2.1.4 实验所需主要试剂
            2.1.5 实验所需主要仪器
        2.2 实验方法
            2.2.1 体外分离及培养BMDCs细胞
            2.2.2 FITC体外标记HBcAg-E7_49-57 VLPs
            2.2.3 共聚焦显微镜观察DOTAP有效促进BMDCs对HBcAg-E7_49-57 VLPs的摄取
            2.2.4 DOTAP有效促进BMDCs对HBcAg-E7_49-57VLPs的摄取效率
            2.2.5 检测BMDCs的成熟情况
            2.2.6 核酸佐剂联合应用对HBcAg-E7_49-57 VLPs促进BMDCs的MHC-I递呈的影响
            2.2.7 ELISA检测BMDCs刺激上清炎性细胞因子的含量
            2.2.8 HBcAg-E7_49-57重组蛋白的表达纯化以及病毒样颗粒的鉴定
            2.2.9 DOTAP递送核酸佐剂对HBcAg-E7_49-57 VLPs免疫干预的影响
            2.2.10 ELISPOT检测分泌IFN-γ的脾脏淋巴细胞水平
            2.2.11 流式细胞术检测细胞表面标记
            2.2.12 包裹抗原及核酸佐剂的纳米颗粒的制备
            2.2.13 包裹抗原的纳米粒的电镜观察以及粒径分析
    3 实验结果
        3.1 CpG、PolyI:C的协同作用对E7特异的抗肿瘤免疫应答的影响
            3.1.1 CpG和PolyI:C作为佐剂的协同效应对小鼠肿瘤生长的影响
            3.1.2 CpG和PolyI:C作为佐剂的协同效应对E7特异的抗肿瘤免疫应答的影响
        3.2 DOTAP阳离子脂质体递送核酸佐剂对HBcAg-E7_49-57VLPs抗肿瘤作用的影响
            3.2.1 体外培养BMDCs的纯度测定
            3.2.2 DOTAP对BMDCs摄取HBcAg-E7_49-57 VLPs效率的影响
            3.2.3 DOTAP对HBcAg-E7_49-57 VLPs促进BMDCs成熟的影响
            3.2.4 核酸佐剂联合应用对HBcAg-E7_49-57 VLPs促进BMDCs的MHC-I递呈的影响
            3.2.5 DOTAP递送核酸佐剂以及HBcAg-E7_49-57 VLPs对小鼠肿瘤生长的影响
            3.2.6 DOTAP递送核酸佐剂以及HBcAg-E7_49-57 VLPs对分泌IFN-γ的淋巴细胞水平的影响
            3.2.7 DOTAP递送核酸佐剂以及HBcAg-E7_49-57 VLPs对Th1/CTLs淋巴细胞水平的影响
            3.2.8 DOTAP递送核酸佐剂以及HBcAg-E7_49-57 VLPs对免疫抑制细胞水平的影响
            3.2.9 DOTAP递送核酸佐剂以及HBcAg-E7_49-57 VLPs对记忆T细胞水平的影响
        3.3 新型纳米颗粒靶向递送核酸佐剂对E7特异的抗肿瘤免疫应答的影响
            3.3.1 含不同组分的纳米颗粒的性质鉴定
            3.3.2 纳米颗粒递送核酸佐剂促BMDCs成熟的作用
            3.3.3 纳米颗粒递送核酸佐剂促进BMDCs分泌促炎性细胞因子
            3.3.4 预防性策略检测纳米颗粒递送核酸佐剂对小鼠肿瘤生长的影响
            3.3.5 预防性策略检测纳米颗粒递送核酸佐剂对小鼠抗肿瘤免疫应答的影响
            3.3.6 治疗性策略检测纳米颗粒递送核酸佐剂对小鼠肿瘤生长的影响
            3.3.7 治疗性策略检测纳米颗粒递送核酸佐剂对小鼠抗肿瘤免疫应答的影响
    4 讨论
        4.1 核酸佐剂对免疫系统的影响
        4.2 树突状细胞对抗肿瘤免疫应答的影响
        4.3 核酸佐剂协同作用以及纳米颗粒递送系统的应用对治疗性疫苗的抗肿瘤干预潜能的影响
        4.4 核酸佐剂协同作用以及纳米颗粒递送系统的应用对抗肿瘤免疫应答的影响
    5 小结
        5.1 CpG、PolyI:C的协同作用对E7特异的抗肿瘤免疫应答的影响
        5.2 DOTAP阳离子脂质体递送核酸佐剂对HBcAg-E7_49-57 VLPs抗肿瘤作用的影响
        5.3 纳米材料靶向递送核酸佐剂对E7特异的抗肿瘤免疫应答的影响
展望
参考文献
附录
    附录Ⅰ 英文缩写词
    附录Ⅱ 主要溶液的配制
致谢
个人简历



本文编号：3845543