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广州地区育龄期女性阴道菌群多样性分析

发布时间:2017-06-08 07:03

  本文关键词:广州地区育龄期女性阴道菌群多样性分析,,由笔耕文化传播整理发布。


【摘要】:研究背景:阴道菌群与宿主形成互惠关系,是女性多层面抵御病原菌入侵的重要组成部分,对机体的健康和疾病有着重大影响。近年来16S rRNA基因测序方法的应用,使我们对阴道菌群结构和组成的认识显著提高。在无症状或者健康女性阴道内存在着几种微生物群,多数以乳酸杆菌为主要优势菌,而其他的也由多种大量的厌氧微生物组成。阴道pH值与阴道菌群相关,其可能指示了群落的表现,低pH值(≤4.5)多被认为“健康”的同义词。对物种组成之间更深的认识需要了解它们随着时间的推移或对机体环境改变如何响应,月经和诸如性交、冲洗及其他行为习惯等人类活动对阴道生态系统造成的动态变化,这也是对疾病诊断和评估风险的基础。基于阴道生态系统真正的功能而不只是其简单的组成,更好的理解其“正常”和“健康”,将有助于更明确的界定健康,进一步提高疾病的诊断和开发更个性化的治疗方案,以更好的促进健康和治疗疾病。基于细菌16S rRNA进行测序的第二代高通量测序技术,具有通量高,成本低廉的优点,能够显著改善传统微生物研究方法的不足,获得比较理想的微生物群落数据,为我们研究微生物生态学奠定了良好的方法学基础。本课题组建立了基于Illumina双末端测序16S rRNA标签序列分析微生物群落的新方法,即BIPES,并建立了新的序列聚类工具TSC,操作简便、可定量定性。QIIME可以高效低成本地分析微生物群落。2008年,美国国立卫生研究院(National Institutes of Health, NIH)资助1.57亿美元投资人体微生物计划(Human Microbiome Project, HMP),建立并不断完善了微生物基因数据库,也不断揭示菌群与健康、疾病之间的关联。但是种族、地理、文化、行为等因素均可导致人体阴道菌群结构差异,而生活在中国广州地区育龄期非孕妇人群阴道菌群分布特征、女性性工作者阴道菌群分布特征以及女性月经周期阴道菌群动态变化尚不明确。研究目的:1、阐述中国广州地区育龄期一般女性人群的阴道菌群特征及阴道pH≤4.5和pH4.5中微生物群落的多样性,通过分析pH≤4.5组和pH4.5组的α、β多样性以及菌群构成,用LEfSe在线工具寻找两组中有统计学差异的taxa,进一步展示一般女性阴道菌群多样性。2、揭示特殊女性群体性工作者阴道菌群菌群特征,通过分析女性性工作者与一般女性人群阴道菌群的α、β多样性以及菌群构成,并用LEfSe寻找两组中有统计学差异的taxa,比较女性性工作者与一般女性人群阴道菌群的差异。3、探究阴道菌群随着月经周期的改变是否相对稳定。通过对月经周期阴道菌群的α、β多样性及和阴道菌群的稳定性和弹性分析,探讨随着月经周期改变阴道菌群的变化。研究方法:第一章2014年07月~2014年08月,招募在南方医科大学南方医院健康体检中心进行常规体检的女性志愿者,在常规妇科体检前,告知其研究方案及意义,得到其同意并配合进行采样及相关信息问卷。由经验丰富的妇产科医生,使用窥阴器撑开阴道,在肉眼直视下,使用一次性棉签拭子,采集后穹窿部位阴道分泌物,同时采集三个平行样品。按照入组标准和排除标准,共纳入志愿者99人,年龄19-52岁。采集的样品暂时存放于带有冰盒生物样品运输箱,在4小时内转移至-80℃低温冰箱保存,直到提取样品中细菌的总DNA。使用细菌16S通用引物,PCR扩增阴道拭子样品的16S rRNA V46保守区。将PCR终产物经过Illumina Hiseq 2000平台进行PE100-bp测序后,得到高通量下机原始数据序列,采用QIIME流程分析一般女性阴道菌群特征和pH_≤4.5组和pH4.5组不同pH的α、β多样性和使用在线统计分析工具LEfSe寻找两组中有统计学差异的taxa。生物信息学分析主要包括操作分类单元(Operational Taxonomy Units, OTU)的生成及主成分分析(Principal Coordinate Analysis, PCoA)、假设验证分析、进化树分析及菌群特征性分析、菌属丰富度分析、群落结构多样性分析等。具体流程为使用BIPES进行序列预处理,UEARCH去嵌合体,然后Uclust(USEARCH)做聚类,我们将UCLUST算法相似度参数设定为0.97,表示序列相似度达到97%即可将其归属为同一个OTU。再挑选代表序列,与数据库比对后,用RDP分类器将相似度为97%的序列归到同一种属。通过对代表序列做比对,建系统发育树,综合信息生成BIOM格式的table;最后进行alpha, beta等一系列后期的分析。Chao1、PD_Whole_tree、Shannon、Observed_speices等指数用来评估样品的α-多样性。基于PCoA,分析β-多样性,即不同个体之间的生态距离。应用SPSS20.0统计软件进行统计分析,两组间的比较符合正态分布的采用两独立样品的t检验,不符合正态分布的采取非参数检验K组比较,P0.05为差异具有统计学意义。第二章2013年05月,在广州市某区卫生部门及当地疾病预防控制中心(Center for Disease Control and Prevention,CDC)性病艾滋病防治科的协调和配合下,招募了提供商业性服务女性性工作者进入队列。邀请了性病艾滋病防治科的部分工作人员参加了现场调查取样工作,他们主要负责前期宣传和研究对象招募等工作;本实验室部分人员主要负责进行问卷访谈、标本采集和运输以及数据录入等工作。在研究开始之前对所有的现场工作人员都进行了保密原则、项目特定实施程序以及接受关于人类研究对象保护知情同意过程的培训。样品采集、DNA提取、PCR扩增、PCR产物质控测序、PCR产物测序和数据处理与“第一章”相同。我们采用BIPES分析流程分析女性性工作者阴道菌群特征,比较健康体检中心进行体检的一般女生(Physical Examination Women,PEW)和提供商业性性服务的女性性工作者(Commercial Sex Worker,CSW)两组人群阴道菌群的α、β多样性和使用LEfSe寻找两组中有统计学差异的taxao第三章招募了14位未婚、自述健康的育龄期广州某高校女大学生加入月经周期阴道菌群变化的纵向研究。研究对象在2014年03月10至2014年05月03期间个人进行样品收集。研究对象每隔两天使用一次性棉签拭子在阴道下1/3处轻轻旋转至少十次,然后转移至-80℃低温冰箱保存,在所有样品收集完成后转移至南方医科大学公共卫生与热带医学学院环境卫生系实验室进行细菌总DNA提取。使用细菌16S通用引物,PCR扩增阴道拭子样品的16S rRNA V4保守区。将PCR终产物经过Illumina Hiseq 2000平台进行PE100-bp测序后,得到高通量下机原始碱基序列,采用QIIME分析流程分析随着月经周期阴道菌群是否保持稳定。应用SPSS 20.0统计软件进行统计分析,多组计量资料的比较应用One-Way ANOVA, P0.05为差异具有统计学意义。研究结果:第一章第一、队列入组99个研究对象,我们总共获得了1,450,624条高质量16S rRNA基因序列,平均每个样品14,652条序列。将测序深度标化到2485条,所有的样品纳入后续分析。第二、广州地区女性阴道菌群主要分为五类,其分别以1. L. iners为主要优势菌;2. L. crispatus为主要优势菌;3. L. gasseri为主要优势菌;4. L. crispatus与L. iners同为优势菌;5.Atopobium, Sneathia, Prevotella和Gardnerella等厌氧菌的一种或两种为主要优势菌。第三、阴道pH4.5时,阴道内菌群α多样性升高,微生物种类较多,Prevotella、Sneathia、Anaerococcu、Burkholderia、Bacteroidi、Allisonella、 Dialister和Megasphaera较pH≤4.5有显著性差异;pH≤4.5的阴道菌群中Lactobacillus,Alliosonella有显著性差异。第二章第一、队列共入组71个研究对象,得到共计1,177,008条高质量16S rRNA基因V46序列,平均每个样品16,577条序列。将测序深度标化到1212条,所有的样品纳入后续分析。第二、在属水平,女性性工作者阴道菌群乳酸杆菌属只占44.2%,而Garderella、Prevotella和Sneathia则分别占到了约20%、10%和9%。第三、性工作者的阴道菌群主要聚类为1. L. iners为主要优势菌;2.L.crispatus为主要优势菌;3.Gardnerella为主要优势菌;4.Atopobium, Sneathia和Prevotella等厌氧菌的一种或两种为主要优势菌。其中以L.iners为优势菌群的样品占总样品数约42.3%,以L. crispatus为优势菌群的仅占2.8%。第四、在属水平上,PEW组中主要富集为Lactobacillus, Burkholderia,在CSW组中主要富集Prevotella、Sneathia、Gardnerella和Escherichia/Shigella等菌属。第五、不同场所性工作者菌群组成有差异,两组阴道菌群的总体结构在abund_jaccard和unweighted_unifrac距离的聚类结果可显著的区分为2个不同的部分。第六、PEW组和CSW组菌群构成有差异,两组阴道菌群的总体结构在binary_Jaccard和unweighted_unifrac距离的聚类结果可显著的区分为2个不同的部分。第三章第一、队列最终入组11个研究对象,总共收集了202个样品,我们获得共计3,998,093条高质量16SrRNA基因V4序列,序列数最低为2566条,最高为70,110条,将测序深度标化到1283条,所有的样品纳入后续分析。平均每个样品19,792条序列。第二、阴道菌群随月经周期的变化出现波动,在月经期阴道菌群波动最为明显,优势菌群在月经周期中呈现相互交替或保持绝对优势的变化模式。第三、阴道菌群波动的大小因人而异,有些女性阴道菌群随着月经周期发生动态变化,而有些女性阴道菌群却非常稳定。第四、阴道菌群受环境个人卫生习惯影响显著,出现按照宿舍居住分簇现象。第五、阴道菌群多数以乳酸杆菌占优势地位,而其他则由一个多样的厌氧微生物群落组成。研究结论:一、广州地区女性阴道菌群主要分为五类,其分别以1. L. iners为主要优势菌;2. L. crispatus为主要优势菌;3. L. gasseri为主要优势菌;4. L. crispatus与L. iners同为优势菌;5.Atopobium, Sneathia,Prevotella和Gardnerella等厌氧菌的一种或两种为主要优势菌。二、pH≤4.5的阴道菌群中多以Lactobacillus为优势菌,阴道pH4.5时则严格厌氧性细菌比例较高。三、阴道菌群受行为习惯和生活方式影响较大,一般人群和性工作者、不同服务场所性工作者的阴道菌群结构存在差异。四、阴道菌群随月经周期的变化出现波动,波动的大小因人而异,在月经期阴道菌群波动最为明显,优势菌群在月经周期中呈现相互交替或保持绝对优势的变化模式。
【关键词】:阴道菌群 细菌16S rRNA 性工作者 月经周期
【学位授予单位】:南方医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:R446.19;R711
【目录】:
  • 摘要3-9
  • ABSTRACT9-18
  • 前言18-28
  • 第一章 广州地区一般女性人群阴道菌群的多样性28-50
  • 1.1 材料和方法28-36
  • 1.2 结果36-45
  • 1.3 讨论45-49
  • 1.4 结论49-50
  • 第二章 广州地区女性性工作者阴道菌群多样性及与一般女性阴道菌群多样性比较50-71
  • 2.1 材料和方法50-52
  • 2.2 结果52-66
  • 2.3 讨论66-69
  • 2.4 结论69-71
  • 第三章 连续月经周期阴道菌群变化71-86
  • 3.1 材料和方法71-76
  • 3.2 结果76-81
  • 3.3 讨论81-85
  • 3.4 结论85-86
  • 总结86-87
  • 参考文献87-96
  • 成果96-97
  • 附录97-101
  • 致谢101-103

【共引文献】

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本文编号:431703

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