沉默二氢叶酸还原酶基因对卵巢癌细胞体外生物学行为的影响

发布时间：2017-06-11 17:05

  本文关键词：沉默二氢叶酸还原酶基因对卵巢癌细胞体外生物学行为的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景与目的:二氢叶酸还原酶(dihydrofolate reductase,DHFR)在卵巢上皮癌铂类耐药细胞中高表达。该研究旨在探讨DHFR基因沉默对卵巢癌细胞体外生物学行为的影响,为卵巢癌铂类耐药的治疗奠定基础。方法:设计DHFR基因靶向的发夹状si RNA,筛选出最佳si RNA沉默片段,构建携带有目的基因的慢病毒载体细胞即转染组(DHFR-p GCSIL-SKOV3细胞)及阴性对照组细胞(p GCSIL-SKOV3细胞)。采用流式细胞仪检测3组细胞在不同的顺铂质量浓度(2.5、5.0、10.0和20.0μg/m L)下不同时间段(24、48及72 h)的凋亡情况以及IC_50顺铂质量浓度(4.4μg/m L)的周期变化;采用高效液相色谱法检测不同顺铂质量浓度(2.5、5.0和7.5μg/m L)不同时间段(24和48 h)药物作用后3组细胞内的顺铂浓度。采用透射电镜观察IC_50顺铂质量浓度(4.4μg/m L)3种细胞的超微结构变化。结果:将退火后的双链寡核苷酸片段连接到p GCSIL/GFP载体,测序结果正确。转染SKOV3细胞后,蛋白[质]印迹法(Western blot)鉴定干扰效果。在给药24、48和72 h后,DHFR-p GCSIL-SKOV3、p GCSIL-SKOV3及SKOV3三组细胞的凋亡率随着顺铂质量浓度(2.5、5.0、10.0和20.0μg/m L)的上升而升高,DHFR-p GCSIL-SKOV3细胞给药48和72 h后的凋亡率明显高于p GCSIL-SKOV3及SKOV3细胞,差异有统计学意义(P0.05)。3组细胞在IC_50顺铂质量浓度(4.4μg/m L)给药24和48 h后,转染组G_0/G_1期细胞比例较阴性及空白对照组明显增多,G_2/M、S期则反之;而给药72 h后,3组细胞以G_2/M及S期为主,转染组低于阴性及空白对照组。采用高效液相法检测细胞内顺铂质量浓度时,转染组在2.5和5.0μg/m L顺铂质量浓度给药24和48 h后,其细胞内顺铂浓度均明显高于对照组。转染组在7.5μg/m L顺铂质量浓度给药24 h后,其细胞内顺铂浓度均明显低于对照组细胞,在48 h后却又高于对照组,差异有统计学意义(P=0.034,P=0.014)。未给药时,转染组细胞的微丝明显多于对照组,线粒体亦改变明显。IC_50(4.4μg/m L)给药24和48 h后3组细胞均未见微丝;而给药72 h后微丝明显增多,且排列紊乱。结论:成功构建携带DHFR基因的p GCSIL干扰慢病毒载体的卵巢癌细胞。通过对DHFR下调后耐药性能研究得知,DHFR的下调与经过铂类药物作用的体外卵巢癌细胞的药物耐药性有一定的联系,卵巢癌细胞中下调DHFR基因可以考虑作为多药耐药的逆转机制。
【作者单位】： 广西医科大学附属肿瘤医院妇瘤科;
【关键词】： pGCSIL/GFP载体 二氢叶酸还原酶 高效液相色谱法 凋亡 透射电子显微术
【基金】：国家自然科学基金资助项目(30960404) 广西科学研究与技术开发计划课题(桂科攻14124004) 广西自然科学基金(2014jj AA40673)
【分类号】：R737.31
【正文快照】： 卵巢癌是女性生殖器官常见的肿瘤之一,发病率仅次于子宫颈癌和子宫体癌而列居第3位,但其却是妇科肿瘤中死亡率最高的恶性肿瘤。由于卵巢癌发病隐匿,大部分患者确诊时已为晚期(FIGO分期,Ⅲ期和Ⅳ期)[1]。目前卵巢癌的最佳治疗方案是外科手术和以铂类和紫杉醇为基础的化疗。但因

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