下调RbAp48表达对人宫颈癌细胞增殖转移的抑制作用及其机制的研究

发布时间：2017-06-19 17:15

  本文关键词：下调RbAp48表达对人宫颈癌细胞增殖转移的抑制作用及其机制的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：第一部分下调RbAp48表达对人宫颈癌细胞增殖的抑制作用目的：尽管对肿瘤的治疗已取得了很大的进步,但据美国癌症协会2015年报告,全球范围内宫颈癌并未得到有效的控制,仍位列女性恶性肿瘤中发病和致死的第四位,严重威胁着女性的健康；寻找治疗宫颈癌的新方法已成为当务之急。近年研究发现Rb相关蛋白48 (Retinoblastoma Associated Protein 48, RbAp48,又称RBBP4)在肺癌、肝癌及白血病细胞中呈现异常过表达,显示与肿瘤具有密切的相关性。本研究拟探索RbAp48在人宫颈癌的表达情况,进一步研究下调RbAp48表达对人宫颈癌细胞增殖的影响。方法：1.组织芯片法检测224例人宫颈癌及癌旁组织中RbAp48的表达；2.以siRNA干扰技术下调RbAp48的表达；3.Western blot法检测siRbAp48下调人宫颈癌细胞RbAp48的表达水平；4.MTT、平板克隆实验检测下调RbAp48后对人宫颈癌细胞株Hela、MS751、 SiHa增殖的的影响；5.p-半乳糖苷酶染色检测siRbAp48对Hela、MS751、SiHa细胞衰老的诱导作用；6.流式细胞术检测siRbAp48对细胞周期和凋亡的作用；7.以荷瘤小鼠模型观察下调RbAp48表达对宫颈癌细胞体内增殖的影响。结果：1. RbAp48在人宫颈癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织,宫颈癌组织中呈强阳性者占67.86%(152例),而癌旁组织呈强阳性者为19.15%(9例)(**P0.01)。2siRbAp48可有效下调Hela、MS751、SiHa细胞中RbAp48的表达。3Hela细胞在20nM siRbAp48作用下产生抑制细胞增殖的效果,50nM作用达峰值；效果最明显为转染后第4天,其生存率降至36.11±4.47%。4.MS751细胞在lOnM siRbAp48作用下产生抑制细胞增殖的效果,50nM作用达峰值,效果最明显为转染后第7天,其生存率降至47.80±5.08%。5.SiHa细胞在30nMsiRbAp48作用下产生抑制细胞增殖的效果,50nM作用达峰值；效果最明显为转染后第5天,其生存率为79.35±8.50%。6.细胞克隆实验结果显示：Hela细胞siRNA NC对照组和siRbAp48组克隆形成数分别是87.17±8.63和36.67±2.89(**p0.01)；MS751细胞siRNA NC对照组和siRbAp48组克隆形成数分别是130±8.89和87.33±1.16(**p0.01); SiHa细胞siRNA NC对照组和siRbAp48组克隆形成数分别是36.67±2.31和31.67±2.09(p0.05)。7.Hela细胞在siRbAp48作用48小时后,G2/M期细胞比例上升为32.33±7.14%(**P0.01),显示细胞发生了G2/M期阻滞；MS75 1细胞在siRbAp48作用96小时后G2/M期细胞比例上升为35.61±3.79%(**P0.01),显示同样发生了明显的G2/M期阻滞。8.下调RbAp48后Hela、MS751细胞胞内颗粒增多,p.半乳糖苷酶染色出现蓝染,呈明显的衰老表征。9Hela细胞在siRbAp48作用72小时出现明显凋亡现象,其凋亡率为54.65±9.06%(**P0.01)； MS751细胞在siRbAp48作用 120小时出现明显的凋亡现象, 其凋亡率为32.20±4.47%(*P0.05)。10.体内实验结果表明下调RbAp48明显抑制体内肿瘤的生长。Hela细胞siRNA NC对照组的肿瘤体积为654.30±191.90mmm3,瘤重353.83±84.11mg; siRbAp48组体积为158.23±75.82 mml3(**P0.01)；瘤重107.92±68.51 mg (**P0.01)。MS751细胞siRNA NC对照组肿瘤的体积为182.20±76.09 mm3,瘤重163.78±76.86 mg; siRbAp48组瘤体体积为14.85±18.60mm3(**P0.01)；瘤重20.28±22.59 mg(**P0.01)。11. siRbAp48与顺铂联用24h后,顺铂对Hela细胞的半数致死量从2.5μg/ml降至1.25μg/ml。结论：1RbAp48在人宫颈癌细胞中的表达显著高于癌旁正常组织细胞。2. siRbAp48能有效下调人宫颈癌细胞中RbAp48的表达。3.下调RbAp48表达可至Hela、MS751细胞发生G2/M期阻滞,诱导细胞发生衰老和凋亡,抑制细胞的增殖。4.下调RbAp48能增加人宫颈癌细胞对顺铂的敏感性。第二部分下调RbAp48表达抑制人宫颈癌细胞增殖的机制研究目的：我们先前应用二代测序技术研究发现下调RbAp48可抑制人肺癌A549细胞株Cyclin蛋白家族的表达,并由此引起细胞周期的阻滞,我们推断下调RbAp48对人宫颈癌细胞增殖抑制作用可能也与Cyclin蛋白通路有关,我们就此进行了相关研究,以探明下调RbAp48表达抑制人宫颈癌细胞增殖的作用机制。方法：1Western blot法检测下调RbAp48表达对人宫颈癌细胞Cyclin蛋白表达的影响；2.应用RNA干扰技术验证Cyclin蛋白家族在下调RbAp48抑制宫颈癌细胞生长中的作用；3. Western blot法检测Cyclin作用下游蛋白CDK2、 CDK4、CDK6、Rb、E2F1等的表达；4.以联合共转染的方法观察相关蛋白在siRbAp48抑制宫颈癌细胞生长中的作用；5.MTT法检测细胞体外增殖能力。结果：1siRbAp48下调RbAp48表达后,Hela、MS751细胞的Cyclin D1、CyclinEl及Cyclin H的表达均明显下调；相应的CDK2、CDK4、CDK6蛋白也明显下调。2.下调RbAp48表达后Hela、MS751细胞的磷酸化Rb (P-Rb)和E2F1明显降低。3.与Hela、MS751细胞不同,SiHa细胞在下调RbAp48表达后,尽管Cyclin E1、CDK2、CDK4、CDK6、P-Rb、E2F1表达也均发生下调,但Cyclin D1、Cyclin H的表达并未发生明显的变化。4.以siRb下调Rb表达后显著拮抗siRbAp48对细胞增殖的抑制作用；在Hela细胞,生存率由34.94±2.71%提高到56.12±2.72%(**P0.01)；在MS751细胞,生存率由44.24±5.83%提高到86.04±9.28%(**P0.01)；在SiHa细胞,生存率由80.03±7.65%提高到92.36±4.89%(**P0.01)。5.应用siCyclin D1、siCyclin E1和siCyclin H能有效下调宫颈癌细胞中Cyclin D1、Cyclin E1和Cyclin H的表达；下调Cyclin D1和Cyclin H的表达后,能显著抑制宫颈癌细胞的增殖,但下调Cyclin El表达后抑制宫颈癌细胞增殖的效果则相对较弱。在Hela细胞中,siCyclin D1、 siCyclin H和siCyclin E1组的生存率分别为39.19±7.77%、40.10±4.02%和82.83±5.94%；在MS751细胞中,siCyclin D1、siCyclin H和siCyclin E1组的生存率分别为51.55±11.70%、49.61±7.51%和88.88±12.80%；在SiHa田胞中,siCyclin D1、siCyclin H和siCyclin E1组的生存率分别为64.34±4.45%、80.74±11.57%和88.25±8.43%。6.以siRb下调Rb表达后能拮抗siCyclin D1对细胞增殖的抑制作用。在Hela细胞,生存率由34.00±3.43%提高到46.54±2.96%(**P0.01)；在MS751细胞,生存率由50.41±4.17%提高到60.05±5.05%(**P0.01)；在SiHa田胞,生存率由66.05±6.56%提高到98.33±5.61%(**P0.01)。7.下调Rb表达后可拮抗siCyclin H对细胞增殖的抑制作用。在Hela细胞,生存率由43.68±4.13%提高到77.54±5.47%(**P0.01)；在MS751细胞,生存率由56.29±5.00%提高到86.84±6.95%(**P0.01)；在SiHa细胞,生存率由85.78±2.47%提高到97.54±3.57%(**P0.01)。结论：1.下调RbAp48表达显著抑制宫颈癌细胞中CyclinD1、CyclinE、CyclinH的表达。2.下调CyclinD1或CyclinH后可产生与下调RbAp48相同的抑制细胞增殖的效果。3.siRb可拮抗siRbAp48、si Cyclin D1及Cyclin H抑制人宫颈癌细胞增殖的作用。4.下调Cyclin D1、Cyclin H表达,诱导细胞周期阻滞是siRbAp48巾制人宫颈癌细胞增殖的一个重要机制。5.下调Rb表达可降低siRbAp48抑制宫颈癌增殖的效果,表明siRbAP48对肿瘤的抑制作用部分是通过调节Rb-E2F通路实现的。第三部分下调RbAp48表达对人宫颈癌细胞株MS751迁移侵袭的抑制及其机制研究目的：肿瘤转移是宫颈癌难以治愈的一个重要原因,抗迁移侵袭是根治宫颈癌的一个重要环节,为此我们探讨了下调RbAp48表达对人宫颈癌细胞迁移侵袭的影响及其作用机制。方法：以划痕实验、Transwell小室检测下调RbAp48表达后对人宫颈癌细胞株MS751迁移侵袭的影响,以Western bolt检测Vimentin、 N-cadherin、E-cadherin、Snail、Twist、MMP-2、TIMP-2蛋白的表达。结果：1.划痕实验和Transwell小室实验结果显示下调RbAp48表达后MS751细胞的迁移和侵袭数均明显减少(**P0.01)。2.siRbAp48作用后MS751的间质细胞表型蛋白Vimentin、N-cadherin、MMP-2表达明显受到抑制；而上皮细胞表型蛋白E-cadherin、TIMP-2表达明显升高, 表明MS751细胞的上皮-间充质样变(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)受到了抑制。3.进一步研究发现EMT上游调节蛋白Snail、Twist表达水平也发生了显著下调。结论：下调RbAp48表达能有效抑制宫颈癌MS751细胞株的上皮.间充质样变,从而降低了细胞的迁移和侵袭能力；其作用机制与降低Snail、Twist的表达有关。
【关键词】：RbAp48 宫颈癌 细胞 衰老 凋亡 顺铂 RbAp48 宫颈癌 Cyclin D1 Cyclin E1 Rb PRb E2F1 RbAp48 宫颈癌 迁移 侵袭 上皮-间充质样变
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.33
【目录】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-16
• 第一部分 下调RbAp48表达对人宫颈癌细胞的增殖抑制作用16-57
• 1.1 前言16-18
• 1.2 实验材料18-25
• 1.3 实验方法25-37
• 1.4 结果37-54
• 1.5 讨论54-56
• 1.6 结论56-57
• 第二部分 下调RbAp48表达抑制人宫颈癌细胞增殖的机制研究57-75
• 2.1 前言57-58
• 2.2 实验材料58-59
• 2.3 试验方法59-61
• 2.4 结果61-72
• 2.5 讨论72-73
• 2.6 结论73-75
• 第三部分 下调RbAp48表达对人宫颈癌细胞株MS751迁移侵袭的抑制作用及其机制研究75-87
• 3.1 前言75-76
• 3.2 实验材料76-77
• 3.3 试验方法77-78
• 3.4 结果78-84
• 3.5 讨论84-86
• 3.6 结论86-87
• 参考文献87-92
• 中英文缩写词对照表92-93
• 硕士期间发表论文93-94
• 致谢94-95

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