替西罗莫司协同顺铂对宫颈癌Hela细胞的作用及其机制研究

发布时间：2017-07-02 05:17

  本文关键词：替西罗莫司协同顺铂对宫颈癌Hela细胞的作用及其机制研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景:宫颈癌作为一种严重威胁女性健康的疾病,由于其具有易复发、易转移的特点,使得宫颈癌的化学药物疗法日益受到关注。治疗中使用到的化疗药物以铂类为主,虽然化疗效果值得肯定,但毒副作用明显,易发生肿瘤转移、耐药等困扰,临床极为期待新的有效的化疗组合方案。已有研究证明,m TOR抑制剂雷帕霉素及其类似物依维莫司和替西罗莫司都可以和顺铂联合使用,是治疗肿瘤的潜在组合药物。m TOR抑制剂主要以m TOR蛋白为靶点有效地抑制肿瘤细胞的增殖生长,促进肿瘤细胞的凋亡,逆转肿瘤细胞对化疗药物顺铂的耐药性。尽管越来越多的证据表明m TOR抑制剂与顺铂这种联合治疗在抗肿瘤领域应用的巨大潜力,但是替西罗莫司与顺铂的联合使用对宫颈癌的研究并无报道,且对其详细的作用机制尚不清楚。目的:本课题在细胞水平,考察替西罗莫司与顺铂对宫颈癌Hela细胞的有效性,筛选出最佳的药物联用组合方案,同时探索替西罗莫司与顺铂联合作用的机制。方法:1.采用MTT比色法考察替西罗莫司与顺铂单独或联合作用于对宫颈癌Hela细胞24h、48h、72h的抗增殖活性,计算半数抑制浓度IC50,筛选出最优的组合方案;2.采用流式细胞术考察替西罗莫司与顺铂联合作用对宫颈癌Hela细胞的诱导凋亡作用及周期阻滞作用,探讨联用组合方案的有效性;3.采用Transwell小室模型考察替西罗莫司与顺铂联合作用对宫颈癌Hela细胞的抗侵袭能力,考察联用组合方案对肿瘤微环境的影响。4.采用Western Blot法考察替西罗莫司与顺铂单独或联合应用对宫颈癌Hela细胞中m TOR信号通路相关蛋白m TOR、70s6k、4EBP1,周期相关蛋白cyclin D1及凋亡相关蛋白cleaved-PARP、bcl-2的表达水平的影响。结果:1.MTT结果表明替西罗莫司与顺铂联合作用于宫颈癌Hela细胞显示出优于单独给药处理的抗增殖活性。经过对半数抑制浓度IC50的计算,结果显示在加入替西罗莫司时,Hela细胞对顺铂的敏感度增强,联用组合IC50值为0.726±0.550,相较于顺铂单药(1.115±0.239)有所降低。此外,通过对联合指数CI的计算可知联用组合方案主要表现出协同效应(CI1)。2.流式细胞术检测替西罗莫司与顺铂联合对宫颈癌Hela细胞的促凋亡作用结果显示,替西罗莫司与低浓度的顺铂联合作用时,其凋亡率提升至34.617±3.201%,显著高于两种药物单独处理的凋亡率3.流式细胞术检测替西罗莫司与顺铂联合的周期阻滞作用结果显示,联合用药组导致了细胞周期的重新分布,明显抑制了G2/M期细胞的转化,引发S期检查点失调,导致S期细胞的聚集积累。0.75μg/m L顺铂单独处理48h后的Hela细胞表现出均匀分布在G2期(45.01±4.1%)和S期(42.87%±6.78%),在加入0.05μmol/L和0.1μmol/L替西罗莫司后,G2期细胞百分比为30.21±3.56%、34.94±5.04%,S期细胞百分比为61.62±6.60%、56.42±4.89%。4.Transwell小室模型考察联合用药组对宫颈癌Hela细胞侵袭能力的结果显示,联合用药可以有效抑制细胞的侵袭能力。这一结果说明二者的联合作用在肿瘤微环境中起到了一定的抗血管生成作用。5.Western Blot法检测m TOR信号转导途径关键蛋白的表达结果表明,联合用药组主要是通过对m TOR信号转导途径的介导,抑制其下游蛋白70s6k、4EBP1的磷酸化,阻断肿瘤细胞的生存通路来协同顺铂发挥细胞毒性。同时,替西罗莫司与顺铂联合作用可以有效地降解DNA修复酶PARP,抑制负调控凋亡蛋白bcl-2的表达并抑制细胞周期蛋白家族cyclin D1蛋白的表达从而调控细胞周期分布。结论:实验结果表明替西罗莫司可以协同顺铂增强其抗宫颈癌细胞的活性,主要是通过PI3K/AKT/m TOR信号转导途径发挥二者协同效应。另一方面,替西罗莫司通过抑制细胞周期蛋白家族的cyclin D1蛋白的表达,阻止其与细胞周期蛋白依赖激酶相结合,调节酶活性协调周期进程,诱发细胞进一步分裂的DNA、蛋白质、促成熟因子无法顺利合成,将更多的细胞阻滞在DNA合成期,从而更有效地诱发肿瘤细胞的凋亡。这些结果为替西罗莫司与顺铂的联合用药提供了基础。
【关键词】：替西罗莫司 顺铂 宫颈癌 mTOR信号通路 协同效应
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.33
【目录】：

• 缩略语说明5-6
• 摘要6-8
• Abstract8-11
• 第一章 综述11-23
• 1.1 宫颈癌的主要治疗手段11-12
• 1.2 传统靶向化疗药物顺铂12-15
• 1.2.1 顺铂的抗肿瘤作用12-13
• 1.2.2 顺铂的作用机制13-15
• 1.3 新型mTOR抑制剂替西罗莫司15-21
• 1.3.1 替西罗莫司简介15-16
• 1.3.2 替西罗莫司的抗肿瘤活性及其作用机制16
• 1.3.3 替西罗莫司的抗血管生成作用及其作用机制16-17
• 1.3.4 替西罗莫司抗肿瘤治疗的临床应用17-18
• 1.3.5 替西罗莫司与其他药物联合应用的研究18-21
• 1.4 课题的提出21-23
• 第二章 材料与方法23-33
• 2.1 材料与仪器23-24
• 2.1.1 细胞系23
• 2.1.2 材料23
• 2.1.3 主要仪器23-24
• 2.1.4 主要溶液配制24
• 2.2 方法24-33
• 2.2.1 细胞的培养24-25
• 2.2.2 细胞形态学观察25-26
• 2.2.3 MTT比色法检测药物对细胞的增殖抑制作用影响26
• 2.2.4 流式细胞术检测药物对细胞周期阻滞作用影响26
• 2.2.5 流式细胞术检测药物对细胞促凋亡作用影响26-27
• 2.2.6 Transwell小室模型检测药物对细胞侵袭能力的影响27-28
• 2.2.7 Western blot检测药物对mTOR通路相关蛋白及周期、凋亡蛋白的影响28-31
• 2.2.8 分析及统计学方法31-33
• 第三章 实验结果33-49
• 3.1 替西罗莫司与顺铂联合作用对Hela细胞的形态学的改变33
• 3.2 替西罗莫司与顺铂单独或联合作用对Hela细胞的抗增殖活性33-39
• 3.2.1 顺铂对Hela细胞的抗增殖活性33-35
• 3.2.2 替西罗莫司对Hela细胞的抗增殖活性35-36
• 3.2.3 替西罗莫司可以增强顺铂的抗增殖活性36-38
• 3.2.4 替西罗莫司与顺铂表现出协同效应38-39
• 3.3 替西罗莫司与顺铂联合作用对Hela细胞的促凋亡作用39-40
• 3.4 替西罗莫司与顺铂联合作用对Hela细胞的周期阻滞作用40-42
• 3.5 替西罗莫司与顺铂联合作用对Hela细胞的侵袭能力的影响42-44
• 3.6 替西罗莫司与顺铂联合对mTOR通路相关蛋白表达水平的影响44-45
• 3.6.1 对mTOR靶点的影响44
• 3.6.2 对mTOR信号转导通路下游蛋白的影响44-45
• 3.7 替西罗莫司与顺铂联合对凋亡和周期相关蛋白表达水平的影响45-49
• 3.7.1 对凋亡相关蛋白的影响45-46
• 3.7.2 对周期相关蛋白的影响46-49
• 第四章 讨论与分析49-55
• 4.1 替西罗莫司协同顺铂增强细胞毒性49-51
• 4.2 替西罗莫司联合顺铂作用的抗肿瘤机制51-55
• 4.2.1 通过抑制PI3K/AKT/mTOR通路活性51-52
• 4.2.2 抑制肿瘤细胞S期向G2期的转化52-53
• 4.2.3 对肿瘤细胞侵袭能力的影响53-55
• 第五章 总结与展望55-57
• 5.1 全文总结55
• 5.2 创新点55-56
• 5.3 展望56-57
• 参考文献57-67
• 致谢67-69
• 硕士期间发表论文和奖励情况69

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本文编号：508685