康普瑞汀磷酸钠对孕鼠胚胎毒性和致畸性的初步研究

发布时间：2017-07-20 15:16

  本文关键词：康普瑞汀磷酸钠对孕鼠胚胎毒性和致畸性的初步研究

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【摘要】：癌症是威胁人类健康、造成死亡的主要疾病之一。目前临床上可通过手术切除肿瘤病灶、化疗、放疗等来治疗癌症,其中给予患者抗肿瘤药物的化疗方式是比较重要的治疗方法。妊娠同时并发恶性肿瘤的几率并不高,但随着肿瘤发病年轻化、低龄化趋势的出现,临床上妊娠合并恶性肿瘤的患者也在逐年增多。对于不适合手术的恶性肿瘤合并妊娠患者,当其不愿意终止妊娠、但肿瘤病情又不能推迟到分娩后再行治疗时,选择安全的化疗药物是可行的治疗方法。但目前临床上应用的化疗药物中大部分是传统的具有细胞毒性的药物,机体易产生耐药性,杀伤细胞时特异性不强,在破坏肿瘤细胞的同时会影响正常细胞的功能,显然这类传统的细胞毒性药物不适用于妊娠合并恶性肿瘤的患者,因此研发新型细胞毒性药物是目前各国研究人员关注的热点问题。新型靶向细胞毒性药物多具有从天然化产物(如植物、海洋生物等)中寻找的化学结构和活性成分,能区分正常细胞和肿瘤细胞之间的差异,从而达到治疗时高选择性、低毒性的效果。康普瑞汀磷酸钠(Combretastatin A-4 disodium phosphate,CA4P)是Combretastatin A-4(CA-4)的磷酸钠盐形式,是一种尚未上市的新型细胞毒性药物,主要与细胞内的秋水仙碱位点结合来抑制细胞内微管蛋白的聚合及细胞有丝分裂,使细胞停止增殖而杀伤肿瘤细胞,该药物是微管蛋白抑制剂类抗肿瘤药物的典型代表。传统的微管蛋白类抑制剂需达到病人对该肿瘤药物的最大耐受剂量附近时才能更好的发挥抗肿瘤作用,而CA-4只需最大耐受剂量的十分之一即可发挥其强大的抗肿瘤作用。它对多种肿瘤细胞具有细胞毒性,包括部分多重耐药肿瘤细胞。但是由于CA-4的水溶性很差,经血管给药困难,故将其制成了磷酸钠盐形式(CA-4P),这极大地改善了CA-4的水溶性和药代动力学性质。由于磷酸脂酶在肿瘤血管内皮细胞中的浓度高于正常细胞,CA-4P进入体内后使在肿瘤血管中被该酶选择性激活,可靶向释放出CA-4从而发挥抗血管、抗肿瘤的作用,是比较有前景的血管靶向剂。但是这个新型靶向药物能否用于妊娠合并肿瘤患者的治疗以及对妊娠母体和发育中的胎儿是否有毒性作用,尤其是致畸性如何尚未见明确报道。出生缺陷和先天畸形是常见并且后果严重的异常妊娠的结局,在给患儿本身及其家庭带来身心痛苦和经济压力的同时,也会增加社会负担,而妊娠期间的不合理用药是导致出生缺陷和先天畸形的主要因素之一。本研究选用妊娠SD大鼠作为实验动物,在其致畸敏感期给药,初步探讨该药对孕鼠有无胚胎毒性及致畸毒性,并探索其安全治疗给药窗,为临床上该药对妊娠合并恶性肿瘤患者的治疗及合理用药提供参考依据。第一部分康普瑞汀磷酸钠对孕鼠的胚胎毒性及致畸性研究目的:观察康普瑞汀磷酸钠(Combretastatin A-4 disodium phosphate,CA4P)对SD孕鼠的胚胎毒性及致畸作用。方法:实验时将性成熟SD雄鼠及雌鼠按1:1合笼交配,次日晨8点检查雌鼠阴道有无乳白色阴栓来判断交配是否成功,以查见阴栓当日记为受孕的第0日(GD0)。将交配成功的雌鼠随机分为低、中、高剂量实验组及溶媒对照组,每组20只。于妊娠第6~15日经尾静脉注射分别给予CA4P 0.15mg/kg、0.50mg/kg、1.50mg/kg(分别是临床等效剂量的1倍、3倍,10倍),溶媒对照组经尾静脉注射给予生理盐水,给药容积均为10ml/kg,每日1次。给药期间观察孕鼠一般情况,并在妊娠第0、6、15、20日称量孕鼠体重;妊娠第20日处死孕鼠,检查孕鼠妊娠及胎鼠畸形情况,并逐个称量子宫连胎重量、子宫重量、胎盘重量及活胎重量,统计卵巢黄体、吸收胎、死胎及活胎数目,计算胚胎着床率、活胎率、吸收胎率、死胎率;逐个测量活胎顶臀长度,鉴定胎鼠性别。大致观察胎鼠外观畸形情况后将每窝胎鼠的一半放于Bouin氏液中,固定2周后取出,采用Wilsons切片法对胎鼠的头部进行检查,观察口、眼、鼻、脑室等有无发育畸形;剪开胎鼠的胸腹腔,逐步检查心、肝、脾、肺、肾的位置、数目、大小及形状等;将每窝胎仔的另一半用95%乙醇溶液浸泡固定2周后,用茜红素应用液染色,再经三种不同浓度甘油溶液透明后在解剖显微镜下检查骨骼畸形情况。结果:与溶媒对照组相比,0.15mg/kg剂量组孕鼠及胎鼠未见明显毒性表现,差异无统计学意义(p0.05);0.50mg/kg剂量对孕鼠未见明显毒性反应,但对活胎体重、胎盘重量、活胎顶臀长以及尾椎骨书、掌骨数、枕骨数、胸骨数有明显影响,差异有统计学意义(p0.05);1.50mg/kg剂量对孕鼠体重增长、胚胎着床率、吸收胎率、活胎率、活胎体重、活胎顶臀长、胎盘重量以及尾椎数、掌骨数、枕骨数、胸骨数均有影响,差异有统计学意义(P0.05)。各剂量组胎鼠未见明显的心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肺脏等重要脏器畸形及外观畸形。结论:本实验条件下,CA4P对亲代孕鼠以及胚胎、胎仔发育未观察到不良反应的剂量水平分别为0.50mg/kg和0.15mg/kg,对胎仔未观察到致畸作用的剂量水平是1.50mg/kg。第二部分康普瑞汀磷酸钠胚胎毒性的机制初探目的:初步探讨康普瑞汀磷酸钠(CA4P)是否影响了母胎界面Th1、Th2细胞因子平衡从而导致孕鼠吸收胎增多。方法:将交配成功的雌鼠随机分为低、高剂量实验组及溶媒对照组,每组12只,于妊娠第6~14日经尾静脉注射分别给予CA4P 1mg/kg、3mg/kg体重,溶媒对照组经尾静脉注射给予生理盐水,给药容积为10ml/kg,每日1次。妊娠第14日处死低、高剂量组及溶媒对照组孕鼠各6只,余下每组孕鼠于妊娠第20日处死;钝性剥离孕鼠胎盘及子宫蜕膜组织,经酶消化、洗涤、离心后取原代细胞;调整细胞数为5×106个/ml接种在24孔板中,并放置于37℃、含5%CO2的细胞培养箱中进行原代细胞共培养;24小时后收集细胞上清,用Elisa酶联免疫法检测细胞上清中IFN-γ、IL-10、IL-4的量,并计算不同剂量组、不同孕期母胎界面细胞上清中Th1/Th2(IFN-γ/IL-10)细胞因子比值。结果:与溶媒对照组相比,1mg/kg的给药剂量对孕鼠整个孕期的母胎界面IFN-γ、IL-10的分泌量无明显影响,差异无统计学意义(P0.05);Th1/Th2平衡无明显偏移趋势(P0.05);当给药剂量为3mg/kg时,孕鼠不同孕期母胎界面的IFN-γ表达量未见明显差异;但IL-10的分泌量随给药剂量的增高而明显降低,与对照组比较差异明显,有统计学意义(p0.001);妊娠第14日时,高剂量组Th1/Th2平衡明显Th1方向偏移,差异有统计学意义(p0.01);妊娠第20日时,高剂量组母胎界面Th1/Th2细胞因子平衡明显向Th1方向漂移,差异有统计学意义(P0.05)。结论:在本实验条件下,CA4P不影响母胎界面IFN-γ的分泌量;高剂量时可使母胎界面IL-10分泌量降低,导致Th1/Th2细胞因子平衡向Th1方向移动,而影响妊娠的维持。全文总结:1、本实验条件下,CA4P对亲代孕鼠以及胚胎、胎仔发育未观察到不良反应的剂量水平分别为0.50mg/kg和0.15mg/kg,对胎仔未观察到致畸作用的剂量水平是1.50mg/kg。该药在用于妊娠合并恶性肿瘤患者时,若超过安全剂量则有导致胚胎宫内发育迟缓、甚至胎死宫内可能,可能有潜在的致畸性。2、CA4P引起妊娠胚胎丢失的原因很多,但从免疫学角度看,该药在体内超过一定剂量时可导致母胎界面Th1/Th2平衡向Th1方向漂移,从而导致妊娠的终止,吸收胎增多。由于目前对CA4P的相关研究较少,至于它是直接通过细胞毒作用损伤了母胎界面分泌Th1、Th2型的免疫细胞及滋养细胞,导致了平衡偏移,还是像传统化疗药物一样影响了机体全身免疫反应,从而导致母胎界面Th1/Th2平衡被动的偏移机制尚不清楚,仍待进一步的研究。
【关键词】：CA4P 大鼠 胚胎毒性 致畸性 吸收胎 Th1、Th2细胞因子 IFN-γ IL-10
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R714.2
【目录】：

• 摘要5-9
• Abstract9-13
• 英文缩略词表13-14
• 前言14-17
• 第一部分 康普瑞汀磷酸钠对孕鼠的胚胎毒性及致畸性研究17-31
• 一、材料与方法17-21
• 二、实验结果21-27
• 三、讨论27-30
• 四、小结30-31
• 第二部分 康普瑞汀磷酸钠胚胎毒性机制的初步探讨31-40
• 一、材料与方法32-35
• 二、实验结果35-37
• 三、讨论37-39
• 四、小结39-40
• 全文总结40-41
• 参考文献41-46
• 综述 妊娠合并妇科恶性肿瘤的治疗进展46-58
• 参考文献53-58
• 攻读学位期间发表论文和参加科研工作情况说明58-59
• 致谢59

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本文编号：568658