miR-21在电离辐射诱导宫颈癌细胞自噬中作用的研究

发布时间：2017-07-26 04:02

  本文关键词：miR-21在电离辐射诱导宫颈癌细胞自噬中作用的研究

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【摘要】：自噬是细胞处于应激或损伤条件下，通过对细胞内长寿命蛋白或废用细胞器的降解，将降解产物包裹形成自噬体并由溶酶体降解，以维持细胞新陈代谢和实现物质再利用的过程。自噬对肿瘤的发生发展起着重要作用，表现在截然不同的两个方面。一方面，自噬作为Ⅱ型程序性死亡方式，发挥抗肿瘤作用；另一方面，自噬作为一种适应性反应，可以保护肿瘤细胞对抗不利环境。 microRNA是一类小片段、进化保守的非编码单链RNA，通过与靶基因3’UTR的结合，引起mRNA降解或转录抑制，从而抑制靶蛋白的合成，调控靶基因的功能，进而调控细胞的增殖、凋亡、自噬等。近年来，多项研究证实miR-21具有癌基因的作用，在乳腺癌、胶质母细胞瘤、前列腺癌和结肠癌中均有高表达。辐射治疗是宫颈癌常规的治疗手段之一，约80％的宫颈癌患者接受单独的放疗或联合放疗的综合疗法。虽然miR-21在宫颈癌细胞的高表达也已被证实，但研究还不广泛，miR-21与细胞自噬的关系及miR-21对电离辐射诱导细胞自噬的作用机制研究还未见报道。 目的 以人宫颈癌细胞株HeLa和SiHa为研究对象，阐述miR-21在电离辐射诱导的宫颈癌细胞自噬中的作用及其机制，并探讨miR-21在宫颈癌治疗过程中的作用。 方法 ①细胞株：选用人宫颈癌细胞株HeLa和SiHa为研究对象；②照射条件：应用深部X射线治疗机进行细胞照射，电压180kV，电流18.0mA，滤板为0.25mmCu和1.0mm Al，源靶距60cm，剂量率0.344Gy· min 1；③m iRNA的表达采用Real-Time PCR方法检测；④蛋白表达变化采用Western blot检测；⑤细胞存活检测采用MTT法检测；⑥细胞凋亡和细胞自噬采用流式细胞术检测；⑦磷酸钙共沉淀转染方法构建HeLa-Beclin1Ri细胞模型；⑧采用SPSS18.0软件进行统计学分析，应用Student’s t-test或卡方检验分析数据，P 0.05表示差异有统计学意义；⑨Quantity One软件对蛋白电泳条带进行灰度分析。 结果 1.电离辐射诱导细胞自噬并促进miR-21的表达 HeLa和SiHa细胞经过4Gy照射后，，蛋白电泳检测MAPLC3的表达，发现在照射后16h、24h和32h这3个时间点LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均高于对照组。经qRT-PCR检测，HeLa细胞经照射后miR-21的表达高于假照组1.7倍，SiHa细胞经照射后miR-21的表达略有升高，为假照组的1.15倍。 2.miR-21调节自噬相关基因Beclin1的表达 在HeLa细胞中，给予4Gy电离辐射处理后，Beclin1表达高于假射组，mimic组的Beclin1蛋白的表达高于NC组，并且mimic+4Gy组Beclin1蛋白的表达高于NC+4Gy组。而在SiHa细胞中，Western blot结果显示，IR组Beclin1的表达高于假照组。转染mimic组的Beclin1蛋白表达低于NC组，并且mimic+4Gy组Beclin1蛋白的表达水平低于NC+4Gy组。 3. miR-21在电离辐射诱导HeLa细胞死亡中的作用 ①对细胞存活的影响：HeLa细胞分别转染miR-21NC、mimic、inhibitor NC和inhibitor，转染后24h给予不同剂量的电离辐射治疗（0、4Gy、8Gy）。MTT结果显示，在HeLa细胞中，各个剂量的电离辐射对NC组和mimic组/inhibitor NC组和inhibitor组细胞存活率没有产生明显的影响。②对凋亡的影响：转染mimic后，与NC组相比，细胞凋亡率虽有所增加，但差异无统计学意义。与NC+4Gy组比较，mimic+4Gy组细胞凋亡率明显升高（P0.05）。inhibitor组细胞凋亡率较inhibitor NC组有所下降，联合照射后，凋亡率与对照组比较差异无统计学意义。③对自噬的影响：转染mimic后，与NC组比较，细胞自噬显著增加（P0.05）；联合照射后，mimic+4Gy组自噬率明显高于NC+4Gy组（P0.05）。以上结果说明过表达miR-21可以增加电离辐射诱导的HeLa细胞凋亡和自噬，但对细胞存活无明显作用。 4. miR-21在电离辐射诱导SiHa细胞死亡中的作用 ①对细胞存活的影响：mimic+8Gy组细胞存活率较NC+8Gy组明显升高，表明过表达miR-21可以抑制电离辐射诱导的细胞死亡。②对凋亡的影响：与NC+4Gy组比较，mimic+4Gy组凋亡率明显降低（P0.05）。③对自噬的影响：mimic+4Gy组自噬率低于NC+4Gy组，inhibitor+4Gy组自噬率高于inhibitorNC+4Gy组（P0.05）。提示，在SiHa细胞中过表达miR-21可以抑制电离辐射诱导的自噬，抑制miR-21可以增加电离辐射诱导的自噬。 结论 1. miR-21在宫颈癌HeLa和SiHa细胞中对自噬发挥着不同的调控作用，在HeLa细胞中miR-21促进电离辐射诱导的自噬，在SiHa细胞中抑制电离辐射诱导的自噬。 2.在HeLa细胞中miR-21上调自噬相关基因Beclin1的表达，而在SiHa细胞中miR-21下调Beclin1的表达。 3.在SiHa细胞中，过表达miR-21可以抑制电离辐射诱导的细胞死亡。
【关键词】：miR-21 自噬 宫颈癌 电离辐射 Beclin1
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.33
【目录】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-13
• 英文缩写表13-15
• 第1章 绪论15-27
• 1.1 microRNA15-19
• 1.1.1 miRNA 的生物起源15-16
• 1.1.2 miRNA 的调控机制16-17
• 1.1.3 miRNA 靶基因的预测方法17
• 1.1.4 miRNA 与肿瘤17-19
• 1.1.5 miR-2119
• 1.2 自噬19-24
• 1.2.1 自噬的过程20-21
• 1.2.2 自噬相关通路及基因21-23
• 1.2.3 自噬与肿瘤23-24
• 1.2.4 电离辐射与自噬24
• 1.3 miRNA 与自噬24-25
• 1.4 立题依据25-27
• 第2章 材料与方法27-38
• 2.1 主要试剂及器材27-28
• 2.1.1 试剂27-28
• 2.1.2 器材28
• 2.2 主要仪器28-29
• 2.3 主要实验材料和方法29-38
• 2.3.1 细胞株29-30
• 2.3.2 照射条件与方式30
• 2.3.3 细胞脂质体转染 miRNA mimic/inhibitor30-31
• 2.3.4 RNA 提取与定量31
• 2.3.5 Quantitative real-time (qRT-PCR)31-32
• 2.3.6 蛋白质免疫印记法(Western Blot)32-36
• 2.3.7 流式细胞术检测细胞凋亡36
• 2.3.8 MDC 染色荧光显微镜观察36
• 2.3.9 MDC 染色流式细胞术分析36
• 2.3.10 MTT 比色法检测细胞增殖活性36-37
• 2.3.11 细胞模型的构建37
• 2.3.12 统计学方法37-38
• 第3章 实验结果38-52
• 3.1 电离辐射诱导 HeLa 细胞自噬并促进 miR-21 的表达38-39
• 3.1.1 电离辐射诱导 HeLa 细胞自噬38
• 3.1.2 电离辐射促进 miR-21 的表达38-39
• 3.2 miR-21 在电离辐射诱导 HeLa 细胞死亡中的作用39-43
• 3.2.1 qRT-PCR 检测 HeLa 细胞中 miR-21 转染情况39-40
• 3.2.2 MTT 比色法检测 miR-21 对电离辐射诱导的细胞存活的影响40
• 3.2.3 miR-21 对电离辐射诱导细胞凋亡的影响40-41
• 3.2.4 miR-21 对电离辐射诱导细胞自噬的影响41-43
• 3.3 miR-21 调节自噬相关基因 Beclin1 的表达43-45
• 3.3.1 Western blot 方法验证 miR-21 上调 Beclin1 的表达43-44
• 3.3.2 通过沉默模型验证 miR-21 上调 Beclin1 的表达44-45
• 3.4 电离辐射诱导 SiHa 细胞自噬并促进 miR-21 的表达45-46
• 3.4.1 电离辐射诱导 SiHa 细胞自噬45-46
• 3.4.2 SiHa 细胞中 miR-21 的表达46
• 3.5 miR-21 在电离辐射诱导 SiHa 细胞死亡中的作用46-51
• 3.5.1 qRT-PCR 检测 SiHa 细胞中 miR-21 转染情况46-47
• 3.5.2 MTT 法检测细胞存活47-48
• 3.5.3 miR-21 在电离辐射诱导 SiHa 细胞凋亡中的作用48-49
• 3.5.4 miR-21 在电离辐射诱导 SiHa 细胞自噬中的作用49-51
• 3.6 在 SiHa 细胞中 miR-21 下调 Beclin1 的表达51-52
• 3.6.1 Western blot 方法验证 miR-21 下调 Beclin1 的表达51-52
• 第4章 讨论52-56
• 第5章 结论56-57
• 参考文献57-66
• 作者简介66-67
• 致谢67

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 齐亚莉;张震宇;王洪艳;李金华;龚守良;;电离辐射诱导人乳腺癌细胞自噬与凋亡的关系[J];吉林大学学报(医学版);2009年06期

本文编号：574598