DAZL和BOULE基因促进小鼠早期生殖分化的研究

发布时间：2017-07-30 04:07

  本文关键词：DAZL和BOULE基因促进小鼠早期生殖分化的研究

  更多相关文章： 基因 BDULE基因 原始生殖细胞体外分化

【摘要】：据世界卫生组织(WHO)报道,全球适龄里面有大约15%正在遭受不育不孕症的困扰[1],而我国的调查报告显示,约有10%的已婚夫妇患有不孕不育症,也就是说平均每6对夫妇中就有一对没有办法有自己的孩子。更为严重的是,近年来的数据显示,不育不孕症的发病率呈现上升的趋势。不孕不育症的原因非常多,生殖细胞形成异常是其主要的原因之一。目前,临床上对于不育不孕症的治疗主要采取辅助生殖的手段解决,但是对于某些精子发生障碍的患者,辅助生殖仍然没有办法帮助他们得到健康的子代[1,2]。但是,体细胞重编程(Somatic reprogramming)以及多能性干细胞(Pluripotency stem cells)向生殖细胞分化的技术对解决这个问题而言是一个有效的解决方法[1,3]。原始生殖细胞(Primordial germ cells, PGCs)是最早期的生殖细胞,能反映一种细胞的特征[4,5]。原始生殖细胞具有单能性,能够分化到精子和卵细胞[4,6]。除此之外,原始生殖细胞在合适的培养环境中还能重新获得类似于胚胎干细胞(Embryonic stem cells)的多能性[7-11]。哺乳动物原始生殖细胞特化是在胚胎发育过程中响应特定的信号通路[12-23]下进行的。在胚胎7.25天,胚外外胚层组织分泌BMP信号通路相关的因子作用于外胚层细胞,进而这些细胞获得发育到原始生殖细胞的命运。原始生殖细胞发育过程中,包括两个主要的事件：一个是表观的改变,包括全基因组的去甲基化和甲基化[24-34],印记的擦除和重新建立[35-37]；另一个是多能性的重新获得。因此,对于原始生殖细胞既是研究体外生殖分化的重要对象,又是对表观遗传学等学科进行基础研究的重要对象。目前对于原始生殖细胞的研究国际和国内已经取得了卓越的成绩。目前,日本科学家Mitinori Saitou率领的小组建立了Blimp1-mVenus (BV)和Stella-ECFP(SC)双标记的细胞系,能够灵敏的指示原始生殖细胞的发育过程[1,3,38]；并且通过Bmp4和Bmp8a的诱导得到原始生殖细胞样细胞,进一步分化分化可以得到单倍体精子细胞,通过单精子卵母细胞胞浆内注射可以得到健康的后代；在此基础上,通过过表达Blimp1,Prdm14, Tcfap2c三个生殖特化过程中所必须的基因可以获得PGCLCs。然而,PGCLCs的数量缺乏仍然是在早期生殖分化进行表观遗传学和生化分析的瓶颈之一,因此,如何高效的获得PGCLCs仍然是一个亟待解决的问题。DAZ (Deleted in Azoospermia)家族基因是在在生殖细胞中特异表达的基因家族[39,40],包括三个成员：DAZL, DAZ, BOULE.在小鼠基因组中,只存在位于常染色体上的DAZL和BOULE基因[39,41-43]。DAZ家族基因在蛋白结构上有相同的机构,包括一个保守的RNA识别模块(RNA recognition motif, RRM),以及由24个氨基酸残基组成的DAZ模块。DAZ家族基因主要作用mRNA的3'UTR区[39,44]。DAZL和BOULE的自然缺失和敲除实验证明,DAZL和BOULE是生殖细胞分化必须的基因[45-48]。我们通过在已有建立的整合有Blimp1, Prdm14和Tcfap2c三个过表达基因的含有Blimp1-m Venus和Stella-ECFP报告基因的胚胎干细胞系的基础上,建立了稳定整合有DAZL和BOULE的小鼠胚胎干细胞系。体外早期生殖分化的研究显示,过表达DAZL和BOULE能够促进PGCLC的分化,并且特异基因也有逐步高表达的趋势。小鼠DAZ家族基因可能是通过激活PGCs早期特异基因的表达从而提高PGCLCs的分化效率。本工作揭示DAZL和BOULE基因在早期生殖细胞特化过程中具有一定的功能,为提高生殖细胞分化效率提供了线索。
【关键词】：基因 BDULE基因 原始生殖细胞体外分化
【学位授予单位】：安徽大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R711.6
【目录】：

• 摘要5-7
• abstract7-9
• 综述9-24
• 1. 原始生殖细胞9-19
• 1.1 原始生殖细胞的简介9-10
• 1.2 原始生殖细胞的命运进程10-12
• 1.3 原始生殖细胞的发育潜能12-14
• 1.4 原始生殖细胞命运调控相关的转录因子14-16
• 1.5 原始生殖细胞特异的转录网络16-17
• 1.6 原始生殖细胞的表观重编程17-19
• 1.7 总结19
• 2 DAZL和BOULE基因在生殖系统的关键作用19-24
• 2.1 关于DAZ家族基因的基础知识19-20
• 2.2 DAZL和BOULE基因在小鼠生殖系统中的研究进展20-23
• 2.3 总结23-24
• 前言24-26
• 3 实验材料26-31
• 3.1 实验动物26
• 3.2 主要仪器设备26
• 3.3 实验试剂与耗材26-28
• 3.4 实验主要试剂与配制28-31
• 4 实验步骤与方法31-43
• 4.1 小鼠饲养层细胞的建立与培养31-32
• 4.1.1 CF1小鼠胎儿成纤维细胞的分离与培养31
• 4.1.2 CF1小鼠成纤维细胞制作饲养层细胞31-32
• 4.2 Blimp1-mVenus和Stella-ECFP转基因小鼠胚胎干细胞系的建立32-33
• 4.2.1 BVSC囊胚的获得32
• 4.2.2 胚胎干细胞系的建立32
• 4.2.3 BVSC胚胎干细胞系的建立32-33
• 4.3 质粒抽提33-34
• 4.3.1 菌液的获取33-34
• 4.3.2 质粒大提34
• 4.4 慢病毒的包装34
• 4.4.1 293T细胞扩增34
• 4.4.2 脂质体转染34
• 4.5 Blimp1、Prdm14、AP2γ过表达细胞系的建立34-37
• 4.5.1 小鼠胚胎干细胞系的复苏、扩增35
• 4.5.2 病毒感染35
• 4.5.3 挑取亚克隆筛选建系35-37
• 4.6 过表达DAZL和BOULE小鼠ES细胞系的建立37-38
• 4.7 RNA的提取和反转录38-39
• 4.7.1 总RNA的提取38
• 4.7.2 反转录成cDNA38-39
• 4.8 Real-time PCR39-40
• 4.9 体外生殖分化40-41
• 4.9.1 胚胎干细胞向外胚层样细胞的分化40-41
• 4.9.2 EpiLCs向PGCLCs的分化41
• 4.10 小鼠胚胎干细胞多能性蛋白免疫荧光染色41-42
• 4.11 基因组的提取42-43
• 实验结果与分析43-50
• 1 Blimp1-mVenus和Stella-ECFP双报告基因的小鼠胚胎干细胞系的建立43
• 2 稳定整合Blimp1、Prdml4和AP2γ的小鼠胚胎干细胞系的建立43-45
• 3 DAZL和BOULE转基因的细胞系的建立45-46
• 4 DAZL和BOULE加速PGCLCs的分化进程,提高PGCLCs的分化效率46-50
• 讨论50-51
• 参考文献51-61
• 致谢61

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本文编号：592417