慢病毒介导的利用siRNA干扰人端粒酶逆转录酶在宫颈癌Caski细胞中的研究

发布时间：2017-08-17 15:12

  本文关键词：慢病毒介导的利用siRNA干扰人端粒酶逆转录酶在宫颈癌Caski细胞中的研究

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【摘要】：第一章hTERT基因慢病毒表达载体的构建与鉴定[摘要]目的：构建及鉴定携带沉默人端粒酶逆转录酶基因(human telomerase reverse transcriptase, hTERT)慢病毒表达载体,为进一步研究hTERT基因在宫颈癌中的作用机制奠定基础。方法：以Designer3.0 ( Genepharma)软件设计靶向hTERT基因特异性的小片段RNA (shRNA)干扰序列,将hTERT-shRNA基因片段插入重组慢病毒pGLV3/Hl/GFP+Puro,构建慢病毒表达质LV3-shRNA-hTERT,酶切、DNA测序验证hTERT片段准确性。LV3-shRNA-hTERT与包装质粒共转染293T细胞,浓缩上清液并测定病毒滴度获得重组慢病毒后感染caski细胞。将细胞分为空白对照组(未感染病毒的caski细胞)、阴性对照组(感染空载病毒LV3-shNC的caski细胞)和hTERT干扰组(感染携带LV3-shhTERT慢病毒的caski细胞)。绿色荧光蛋白(GFP)的表达判断转染结果并估计转染效率,流式细胞术仪检测病毒感染率,实时荧光定量PCR法检测转染后基因hTERT mRNA的表达量。结果：将目的序列成功连接到载体上,并经测序分析证实载体构建成功；成功包装成高滴度的慢病毒,且能有效感染子宫颈癌caski细胞。荧光定量PCR检测结果证实构建的hTERT-小片段干扰RNA慢病毒表达载体感染caski细胞后hTERT基因的表达量显著低于空白组和对照组(P0.01)。结论：成功构建了慢病毒表达载体LV3-siRNA-hTERT,能够有效感染宫颈癌caski细胞,并使hTERTmRNA的表达量明显降低,为进一步探讨hTERT基因在子宫颈癌的发病机制和体外基因干预治疗奠定基础。第二章hTERT基因对宫颈癌caski细胞生物学影响的体外研究[摘要]目的：探索宫颈癌caski细胞中hTERT基因表达下调之后对其生物学功能的影响。方法：CCK-8法检测三组细胞(NC、NC-LV、sihTERT-LV)的生长增殖情况,细胞平板克隆实验检测三组细胞的单克隆能力,采用流式细胞仪检测三组细胞周期及细胞凋亡情况。结果：si-hTERT-LV组细胞生长速度、单细胞克隆能力明显低于NC组及NC-LV组,差异有统计学意义(P均0.05)。si-hTERT-LV组G1期细胞比率明显高于NC组和NC-LV组,差异有统计学意义(P均0.05); si-hTERT-LV组S期细胞比率明显低于NC组和NC-LV组,差异有统计学意义(P均0.05)。si-hTERT-LV细胞凋亡率明显高于NC-LV组和NC组,差异有统计学意义(P均0.05)。结论：宫颈癌caski细胞沉默了hTERT基因后,明显抑制细胞的生长,将细胞周期阻滞于GO/G1期,同时抑制其单克隆形成能力,增加细胞凋亡。
【关键词】：宫颈肿瘤 人端粒酶逆转录酶基因 慢病毒载体 小片段RNA caski细胞 宫颈癌 caski细胞 人体端粒酶逆转录酶 细胞增殖 细胞凋亡 细胞周期
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.33
【目录】：

• 个人简历3-7
• 英文缩略词7-9
• 摘要9-12
• ABSTRACT12-16
• 第一章 hTERT基因的慢病毒表达载体的构建及鉴定16-63
• 1. 前言16-17
• 2. 材料与方法17-48
• 2.1 材料17-23
• 2.1.1 实验对象17-18
• 2.1.2 主要实验试剂18-19
• 2.1.3 主要溶液配制19-21
• 2.1.4 主要实验仪器21-23
• 2.1.5 器具处理23
• 2.2 方法23-48
• 2.2.1 表达hTERT-shRNA的慢病毒载体构建23-33
• 2.2.2 慢病毒包装、浓缩、收集33-40
• 2.2.3 用构建好的病毒转染靶细胞40-42
• 2.2.4 稳转细胞系的建立42-43
• 2.2.5 实验分组43-44
• 2.2.6 实时荧光定量PCR反应检测hTERT mRNA水平的表达44-48
• 2.3 统计学方法48
• 3. 结果与分析48-55
• 3.1 重组质粒的鉴定结果48-50
• 3.2 慢病毒滴度的测定50-51
• 3.3 干扰序列的抗性筛选及流式细胞仪检测感染效率51-52
• 3.4 总RNA完整性纯度检测52-53
• 3.5 实时荧光定量PCR检测hTERT基因的变化53-55
• 4. 讨论55-58
• 参考文献58-63
• 第二章 慢病毒介导的利用siRNA沉默hTERT基因对宫颈癌caski细胞生物学功能的影响63-90
• 1. 前言63-64
• 2. 材料与方法64-77
• 2.1 实验对象、实验试剂、实验仪器64-68
• 2.1.1 实验对象64
• 2.1.2 主要实验试剂64-65
• 2.1.3 主要试剂的配置65-67
• 2.1.4 实验仪器67-68
• 2.1.5 实验器具处理68
• 2.2 方法68-77
• 2.2.1 细胞株的培养68-69
• 2.2.2 细胞平板克隆形成实验69-71
• 2.2.3 细胞增殖的CCK-8检测71-73
• 2.2.4 细胞生长周期的检测73-76
• 2.2.5 细胞凋亡的检测76-77
• 2.3 统计学分析77
• 3. 结果与分析77-84
• 3.1 CCK-8法测定细胞生长曲线77-79
• 3.2 细胞平板克隆实验结果79-80
• 3.3 流式细胞仪检测细胞周期结果80-82
• 3.4 流式细胞仪检测细胞凋亡结果82-84
• 4. 讨论84-86
• 参考文献86-90
• 综述90-102
• 参考文献96-102
• 全文小结102
• 研究创新性总结102-103
• 攻读学位期间发表学术论文103-104
• 致谢104-106
• 附件106-111

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前6条

1 章文华;;子宫颈癌防治展望[J];癌症进展;2010年02期

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本文编号：689661