胎儿血红蛋白F增高的分子机理研究

发布时间：2017-09-06 18:20

  本文关键词：胎儿血红蛋白F增高的分子机理研究

  更多相关文章： 血红蛋白F增高 β珠蛋白基因簇基因突变 α珠蛋白基因拷贝数变异Gγ-158(C-T) 多态性 多重连接探针扩增技术 (MLPA)

【摘要】：研究背景与目的血红蛋白(hemoglobin,Hb)是人体内氧的运输体,由血红素和珠蛋白组成。珠蛋白是由两条a珠蛋白链(αξ)和两条非α珠蛋白链(βγδε)组成的四聚体。在人体不同的发育时期,α与β珠蛋白基因簇沿5’到3’端的方向依次表达,生成人体不同时期的类α珠蛋白链与类p珠蛋白链。在胚胎期为Hb Grower 1 (ζ2ε2), Hb Grower2(a2ε2)及Hb Portland (ζ2γ2);在成人期及胎儿期为HbA(α2β2), HbA2(a2δ2)和HbF (α2γ2)。γ链有2种亚型,即Gγ和Aγ,因而组成HbF有两类：α2Gγ2和α2Aγ2,两者高度相似,只是前者的第136位氨酸为甘氨酸,而后者则为丙氨酸。正常成人血红蛋白的主要成份是HbA占96.5%～97.5%；其余成分为：血红HbA2占2.5%-3.5%；HbF为1%以下。出生时HbF占循环血红蛋白的90%,其合成下降始于孕晚期,而在生命的第一年,它逐渐被HbA所替代。当成人体内HBF占人体内血红蛋白的比例大于2%时,就认为HBF增高。当成人体内持续存在过量的HbF时,就称为遗传性持续性胎儿血红蛋白增高症(Hereditary persistence of fetal hemoglobin, HPFH)。HbF的增高并不全是HPFH,一般认为只有那些原发性非α链珠蛋白基因缺陷所引起的HbF水平增高的情况,才称之为HPFH, HPFH通常具有较高水平的HbF。组成HbF的Gγ-链和Aγ-链胎儿期的比例是70：30,在一岁以后及成人期,两者比例转变成40：60。能影响到α,β及γ这三条珠蛋白链的因素都可以导致其组成比例失调,其是HbF水平增高的分子学基础。β-类珠蛋白基因的遗传缺陷的一直以来都是HbF增高的重要学说。由于β珠蛋白基因主要在出生后才有很高的表达水平,其基因突变(包含β基因的点突变与类β基因簇的删除突变)会使其受到不同程度的抑制作用而不能表达或很低水平表达,导致类β珠蛋白基因簇的γ珠蛋白基因重新开放,合成过多的γ链。γ珠蛋白基因启动子区的点突变能够产生了一个促进子元件GGGPyG(Py=嘧啶碱基),或突变令其具有类似于CACCC盒的特征,对蛋白因子CPI的结合能力增强,或突变削弱了CAAT盒可充当负性调控的有效性,这就可以增加γ基因的表达水平,增强γ珠蛋白的转录效率。α珠蛋白基因的拷贝数变异也是HbF增高的一个重要影响因素,正常个体中存在4个α珠蛋白基因,α珠蛋白基因的拷贝数丢失或突变会导致相应的临床表型。α珠蛋白基因的拷贝数增加会产生5个拷贝的α珠蛋白基因(aaaanti307 /aa或aaaaanti4.2 /aa),这一额外增加的的α珠蛋白基因会产生过多的α链,加重α与β链的失衡,加重β地贫患者的临床症状。遗传修饰在HbF增高中起了重要的调节作用,γ基因某些位点(如Gγ-158 C/T位点)的多态性及β珠蛋白基因簇非连锁的数量性状位点(如发现HBFQTL2-6q23跨度1.5 Mb区域与HbF数量性状相关,参与γ-球蛋白基因的表达的调节作用,参与红细胞的生成过程)与HbF增高密切关联。目前,国外对HbF增高的分子机制研究处于系统有序的状态,多数报道都从影响HbF增高的因素出发,采用多方法多手段进行深入的研究分析,且发现不同人种间导致HbF增高的基因突变类型有所差别且种族间的基因突变热区不一、与HbF相关量的遗传修饰因素也存在明显差异。国内对HbF增高分子机制研究尚处于初级阶段,系统研究尚属较少,多见的是对某一方面影响因素的研究。本研究的目的在于：1.较为系统阐明HBF增高的分子机理,丰富对中国人群HbF增高发生机制的研究；2. 深入分析β-类珠蛋白基因的遗传缺陷在HbF增高病例中所起的作用,检测β-珠蛋白基因簇的突变类型,明确基因突变在β基因簇的起始位置,有利于分析基因突变所带来的遗传效应；3.检测α珠蛋白基因的拷贝数变异,阐述α珠蛋白基因拷贝数丢失与增加对HbF的影响,分析其影响HbF水平的分子机制；4. 对中国人群常见的HbF遗传修饰位点行实验学分析,分析常见修饰调控位点在所选病例中的作用；5.基因突变类型与HbF增高水平的差异性分析。材料与方法本研究的样本来自近年来因贫血到南方医科大学南方医院就诊的患者,在分析患者血液表观学检查结果后,在限定PH8.6琼脂糖血红蛋白电泳HbF增高水平大于5%,患者年龄大于2周岁且没有患有再生性障碍性贫血等贫血性疾病等条件下,排除患者为孕妇,共收集HbF增高的病例85例。本研究方法分为四个部分：1.β-珠蛋白链基因簇突变分析：a.采用反向点杂交(RDB)行中国人群常见17个β-珠蛋白基因突变位点分析；b.应用多重探针连接扩增技术(ligation-dependent probe amplification, MLPA)对β-珠蛋白链基因簇行大片段缺失分析,采用Gap-PCR技术对SEA型HPFH和中国型δp地中海贫血进行验证；c.应用sanger测序法对β珠蛋白基因全长测序分析。2.α-珠蛋白链拷贝数变异分析：a.采用Gap-PCR技术检测中国人群α地贫-SEA/、-α3.7/、-α4.2/缺失型致病基因；b.应用MLPA对α-珠蛋白链基因簇行大片段重复分析。3.调控修饰位点分析：Gγ珠蛋白基因上游-158处Xmn Ⅰ位点酶切分析。(4)对HbF增高病例行基因突变类型分析：用卡方检验分析基因突变类型与临床表型的关系。实验结果本研究的实验结果分为八个部分表述：1.对所有纳入本研究的85个HbF增高的病例均检测了α地贫--SEA/、-α3.7/、-α4.2/三中基因缺失型,共检出--SEA缺失杂合子2例,在检出的2例样本中,都复合有β地贫；2.用于本研究的所有病例均作PCR扩增β珠蛋白基因用于RDB检测,检出正常基因型16例,突变杂合子26例,突变纯合子8例,突变双重杂合子35例。这些突变都较为集中的分布在中国人群南方地区的最常见的突变位点,为编码区(Code, CD) 41-42 (-TCTT),内含子区域IVS-2-654 (C-T), TATA box-28 (A-G), CD17 (A-T);3.21个病例采用了MLPA KIT P102检测β珠蛋白基因簇大片段缺失突变,检测出HBB大片段缺失杂合子15例。经查询人类血红蛋白与地中海贫血数据库及采用Gap-PCR来验证SEA-HPFH和中国型δβ地贫后,发现Gγ(Aγδβ)0杂合10例,SEA-HPFH缺失3例,Ducth I 1例,1例缺失类型未明确；4.采用MLPA KIT P140检测α珠蛋白基因的拷贝数变异的6个样本中,检测出2例样本存在α珠蛋白基因簇大片段重复,2例病例存在α珠蛋白基因簇缺失。其中,1例样本为aaaant3.7三联体,1例样本重复发生在ζ与Ψζ基因之间,1例样本在ζ基因上游—9.3 kb处发生杂合性缺失,1例样本在α1基因上游与a2基因之间发生杂合性缺失；5.Gy-158 (C/T)位点行XmnI酶切的21个样本中,13例为-/-(基因型为C/C),6例为+/-(T/C杂合状态),仅有1例为+/+(T/T纯合)：6.用于p基因全长测序分析的6个样本中,除合并RDB检测已发现p基因CD41-42与IVS2-654突变外,测序分析没有发现明显的致病突变,却发现3例样本中存在SNP, SNP为rs1609812与rs 7480526 (Hg19, dbSNP build 138); 7.综合所用的实验方法后,遗传修饰因素及测序结果致病性不确定的不在本综合分析内。在85例样本中,检测出p基因杂合突变22例,p基因双重杂合突变34例,纯合突变6例：p基因簇大片段缺失12例,其中Gy(Aγδβ)0型9例,SEA-HPFH 2例,Ducth I 1例；p基因杂合突变复合p基因簇大片段缺失3例, α地贫--SEA缺失型复合po/βα或β0/β+2例,1例pIVS-2-654复合a基因簇缺失,1例pCD41-42复合aaaant3.7三联体,α基因簇缺失与重复各1例；8.运用卡方检验发现,在HBF增高水平方面,β基因杂合突变与β基因簇大片段缺失在统计学上存在显著差异,β基因双重杂合突变与β基因纯合突变在统计上无显著性差异。结论1.β珠蛋白基因存在转录突变、RNA加工区突变、RNA翻译区突变可导致β珠蛋白合成受到抑制,β链生成减少,导致β与α比例的失衡,为修正这种失衡,出生后关闭的Y基因重新开放,Y珠蛋白合成增多,生成的γ链与过量的α链组成四聚体(α2γ2),从而导致HbF水平的升高；2.α拷贝数的增多会加重α链与β链的不平衡性,加重α链与β链的不平衡性,同时过多α链与γ链组成过量的HbF,导致HbF水平的升高；α拷贝数的减少会修正α与β链比例的失衡,从而减轻β地贫突变的纯合子或双重杂合子贫血症状,从而这类病例归类为中间型β地贫,导致HbF水平的升高；3.Gγ-158位点(C/T)突变也可以使正常成年人HbF轻度增高,是低Hb F水平决定因素之一,在β地贫杂合子中,Hb F往往处于较低水平的状态,然而,合并该位点的突变能够增加γ-珠蛋白的表达,促进γ链的生成,导致Hb F偏向于中等水平。在中间型地贫中,其能调节HbF,使HbF迈向更高的水平；4.相对于β基因杂合突变,β基因簇大片段缺失具有更高HbF水平,而β基因双重杂合突变与p基因纯合突变在HbF水平上则无明显差异;5.β基因上的一些多态性位点对HbF水平的影响性尚属不太清楚。没有对反式调控HbF的β基因簇外的一些数量性状位点与类β珠蛋白基因Gγ、Aγ进行分析是本研究的不足之处。
【关键词】：血红蛋白F增高 β珠蛋白基因簇基因突变 α珠蛋白基因拷贝数变异Gγ-158(C-T) 多态性 多重连接探针扩增技术 (MLPA)
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R714.5
【目录】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-16
• 第1章 前言16-23
• (一) 人类血红蛋白的组成与功能16-18
• (二) 正常人体内的血红蛋白的组成与HbF增高的定义18
• (三) HbF增高的分子基础18-21
• (四) 国内对HbF增高的研究状况与存在的问题21
• (五) 本研究的目的21-22
• (六) 本研究的内容指标22-23
• 第2章 实验材料23-27
• 2.1 研究对象23
• 2.1.1 病例信息23
• 2.1.2 样本的采集23
• 2.2 实验所使用的主要试剂23-25
• 2.3 主要仪器25-26
• 2.4 数据分析软件及数据库26-27
• 第3章 实验方法27-42
• 3.1 本研究所采取的技术路线27-29
• 3.2 外周血DNA的提取29-30
• 3.3 Gap-PCR检测α地贫--SEA/、--α3.7/、-α4.2/缺失型基因30-31
• 3.4 PCR扩增β珠蛋白基因用于RDB检测31-33
• 3.5 MLPA检测β珠蛋白基因簇大片段缺失与α珠蛋白基因簇大片段重复33-36
• 3.6 Gap-PCR验证SEA型HPFH和中国型δβ地贫36-38
• 3.7 ~Gγ珠蛋白基因-158位点Xmn Ⅰ酶切分析38-39
• 3.8 β珠蛋白基因全长测序分析39-41
• 3.9 统计学方法41-42
• 第4章 实验结果42-69
• 4.1 α地贫--~(SEA/)、-α~(3.7)/、-α~(4.2/)缺失型基因检测结果42-43
• 4.2 β珠蛋白基因PCR扩增结果43-44
• 4.3 MLPA检测β珠蛋白基因簇大片段缺失与Gap-PCR验证结果44-53
• 4.3.1 β珠蛋白基因簇大片段缺失MLPA检测结果44-51
• 4.3.2 SEA型HPFH和中国型δβ地贫的Gap-PCR验证结果51-53
• 4.4 α珠蛋白基因拷贝数变异的MLPA检测结果53-54
• 4.5 Gγ-158(C/T)位点Xmn Ⅰ酶切结果54-56
• 4.6 β珠蛋白基因全长测序分析结果56-58
• 4.7 综合分析结果58-65
• 4.8 统计学方法分析基因型与临床表型的关系65-69
• 4.8.1 β基因杂合突变与β基因簇大片段缺失HbF水平差异性分析结果65-66
• 4.8.2 β基因双重杂合突变与β基因纯合突变HbF水平差异性分析结果66-67
• 4.8.3 不同性别间HbF水平差异性分析结果67
• 4.8.4 不同年龄间HbF水平差异性分析结果67-69
• 第5章 分析与讨论69-79
• 5.1 β珠蛋白基因点突变对HbF水平的影响69-73
• 5.2 β珠蛋白基因簇大片段缺失对HbF水平的影响73-75
• 5.3 α 珠蛋白基因簇突变对HbF水平的影响75-76
• 5.4 Gγ珠蛋白基因-158位点的多态性对HbF水平的影响76-77
• 5.5 HbF水平增高病例的基因突变分布77-79
• 第6章 全文小结79-84
• 参考文献84-93
• 附录 英文缩略词表93-95
• 攻读硕士学位期间所发表论文95-96
• 致谢96-97

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 顾援朝;;遗传性胎儿血红蛋白持续存在综合征[J];国外医学(分子生物学分册);1980年04期

2 石之歂,王沙燕,戴勇;地中海贫血分子诊断的研究进展[J];中国生育健康杂志;2003年03期

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本文编号：804704