赖氨酸特异性去甲基化酶1参与卵巢癌细胞对顺铂敏感性的研究

发布时间：2017-09-18 02:21

  本文关键词：赖氨酸特异性去甲基化酶1参与卵巢癌细胞对顺铂敏感性的研究

  更多相关文章： LSD1 基因分子克隆 卵巢癌细胞系SKOV3 稳定转染细胞株 顺铂敏感性

【摘要】：目的初步研究传统化疗药物顺铂对上皮源性卵巢癌细胞SKOV3中组蛋白赖氨酸特异性去甲基化酶1(Lysine Specific Demethylase 1,LSD1)蛋白表达量的调节及其对肿瘤细胞形态功能学的影响;运用基因分子克隆技术构建LSD1干扰及过表达的卵巢癌稳定转染细胞株,分别从细胞增殖、迁移和凋亡三方面探讨靶向调控LSD1基因表达在卵巢癌细胞对顺铂敏感性中的作用。方法(1)观察在浓度梯度的顺铂处理下卵巢癌SKOV3细胞增殖、迁移、凋亡的形态功能学变化,采用Western blot法检测不同浓度顺铂影响下三大功能学相关指标蛋白水平的改变和LSD1及其特异性反应底物组蛋白H3K4甲基化蛋白表达量的变化情况,并筛选出顺铂作用的最佳浓度,用于后续实验研究。(2)扩增、抽提LSD1干扰和过表达质粒,通过琼脂糖凝胶电泳法测定所提各质粒的纯度和验证碱基量的大小。采用Lipofectamine 2000脂质体转染法进行慢病毒包装,获得两种高滴度的LSD1干扰和过表达慢病毒颗粒,分别感染卵巢癌SKOV3细胞,经嘌呤霉素筛选获得沉默LSD1表达的稳定转染细胞株、经嘌呤霉素和遗传霉素G418筛选获得LSD1过表达的稳定转染细胞株,选择多西环素最适工作浓度并诱导卵巢癌细胞中目的基因序列的表达,运用Western blot法鉴定两种SKOV3体外稳转细胞模型是否成功构建。(3)将LSD1干扰和过表达的SKOV3稳转细胞模型作为研究对象,按多西环素(Dox)诱导/不诱导、顺铂(Cisplatin)处理/不处理分为四组,通过MTT实验和Ed U试剂盒检测肿瘤细胞增殖能力的变化、Transwell小室实验观测肿瘤细胞迁移能力的改变、Annexin V/PI双标法细胞染色并经流式细胞仪上机检测细胞凋亡的情况。此外,进一步通过Western blot法从分子水平检测细胞增殖、迁移、凋亡相关蛋白相对表达量的变化情况,从而探究靶向调控LSD1基因表达在卵巢癌细胞对顺铂敏感性中的作用。结果(1)从形态功能学和蛋白表达水平分析,在顺铂作用下卵巢癌细胞增殖、迁移能力明显减弱、细胞凋亡数量显著增加;肿瘤细胞中LSD1相对表达量以顺铂浓度依赖的方式降低,其特异性反应底物H3K4me1、H3K4me2蛋白相对表达量逐渐升高,而H3K4me3无明显变化趋势。(2)实验所构建的慢病毒介导干扰LSD1的卵巢癌稳转细胞株在经多西环素诱导后LSD1相对表达水平降低,而过表达的SKOV3细胞株经诱导后可见LSD1的相对表达水平升高,表明成功干预LSD1基因在卵巢癌细胞SKOV3中的表达。(3)慢病毒沉默LSD1表达的卵巢癌SKOV3细胞株中,干扰LSD1的表达可以抑制细胞增殖、迁移,并促进细胞凋亡;而LSD1过表达细胞株则与之相反,可以促进细胞生长、迁移,抑制细胞的程序性死亡。此外,沉默LSD1的表达可以促进顺铂所诱导的细胞凋亡,增加顺铂对肿瘤细胞的增殖和迁移抑制率;而LSD1的过表达则增加了卵巢癌细胞对顺铂的抵抗作用。结论本研究证实顺铂能够调节SKOV3细胞中LSD1及其甲基化底物H3K4me1、H3K4me2的表达,抑制细胞增殖、迁移能力,并促进细胞凋亡;成功构建靶向干扰和过表达LSD1的两种卵巢癌SKOV3体外稳定转染细胞模型,分别能有效沉默和过表达肿瘤细胞中的靶基因LSD1;靶向干扰LSD1的表达能协同增加顺铂抑制细胞增殖、迁移以及诱导细胞凋亡的能力,能增加卵巢癌细胞对顺铂的敏感性,增强顺铂对肿瘤细胞的杀伤力;而LSD1过表达能拮抗顺铂促进细胞凋亡的能力,降低顺铂对癌细胞生长和迁移的抑制率,增加卵巢癌细胞对顺铂的耐受和抵抗。以上的实验研究发现为LSD1的原癌基因性质提供了新的依据。
【关键词】：LSD1 基因分子克隆 卵巢癌细胞系SKOV3 稳定转染细胞株 顺铂敏感性
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.31
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-13
• 第一章 绪论13-22
• 1.1 卵巢癌的现状13-14
• 1.1.1 卵巢癌13
• 1.1.2 卵巢癌的治疗13-14
• 1.2 表观遗传学14-15
• 1.2.1 表观遗传学的介绍14-15
• 1.2.2 肿瘤表观遗传治疗15
• 1.3 LSD1的研究进展15-17
• 1.4 基因靶向治疗17-20
• 1.4.1 基因克隆技术17-18
• 1.4.2 慢病毒载体p LKO Tet puro18-19
• 1.4.3 慢病毒载体p LVX-IRES-puro19-20
• 1.5 研究方案及技术路线20-22
• 1.5.1 研究方案20
• 1.5.2 技术路线20-22
• 第二章 顺铂对卵巢癌细胞功能学以及LSD1水平的影响22-40
• 2.1 实验材料22-27
• 2.1.1 主要仪器22-23
• 2.1.2 主要试剂23-25
• 2.1.3 主要溶液25-27
• 2.2 实验方法27-32
• 2.2.1 细胞培养27
• 2.2.2 药物处理27
• 2.2.3 蛋白免疫印迹法（Western blot）27-29
• 2.2.4 MTT和Ed U试剂盒检测细胞的增殖能力29-31
• 2.2.5 Transwell小室实验检测细胞的迁移能力31
• 2.2.6 流式细胞术检测细胞凋亡水平31-32
• 2.2.7 统计学分析32
• 2.3 实验结果32-37
• 2.3.1 顺铂对卵巢癌细胞中LSD1表达的调节32-33
• 2.3.2 顺铂对卵巢癌细胞增殖功能的影响33-35
• 2.3.3 顺铂对卵巢癌细胞迁移能力的影响35-36
• 2.3.4 顺铂对卵巢癌细胞凋亡水平的影响36-37
• 2.4 讨论37-40
• 第三章 靶向调控LSD1的卵巢癌稳转细胞株的构建40-50
• 3.1 实验材料40-43
• 3.1.1 主要仪器40-41
• 3.1.2 主要试剂41-42
• 3.1.3 主要溶液42-43
• 3.2 实验方法43-46
• 3.2.1 细胞培养43
• 3.2.2 质粒转化、扩增与抽提43-44
• 3.2.3 质粒的转染44-45
• 3.2.4 病毒上清液感染及稳转细胞株筛选45
• 3.2.5 稳转细胞株的鉴定45
• 3.2.6 统计学方法45-46
• 3.3 实验结果46-49
• 3.3.1 质粒检测及转染情况46-47
• 3.3.2 稳转细胞株的鉴定结果47-49
• 3.4 讨论49-50
• 第四章 靶向调控LSD1影响卵巢癌细胞对顺铂的敏感性50-62
• 4.1 实验材料50-51
• 4.1.1 主要仪器50
• 4.1.2 主要试剂50-51
• 4.1.3 主要溶液51
• 4.2 实验方法51-53
• 4.2.1 细胞培养51
• 4.2.2 药物处理51-52
• 4.2.3 蛋白免疫印迹法（Western blot）52
• 4.2.4 细胞增殖能力的检测52
• 4.2.5 细胞迁移能力的检测52-53
• 4.2.6 细胞凋亡水平的检测53
• 4.2.7 统计学分析53
• 4.3 实验结果53-59
• 4.3.1 检测LSD1干预后在顺铂处理下卵巢癌细胞增殖的变化53-55
• 4.3.2 检测LSD1干预后在顺铂处理下卵巢癌细胞迁移的变化55-57
• 4.3.3 检测LSD1干预后在顺铂处理下卵巢癌细胞凋亡的变化57-59
• 4.4 讨论59-62
• 第五章 主要结论与展望62-63
• 5.1 主要结论62
• 5.2 展望62-63
• 参考文献63-74
• 攻读硕士期间发表的论文74-75
• 致谢75

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 刘爽;林静娴;刘琦;石群立;王建东;吴元赭;;维A酸干预前后卵巢癌细胞中维A酸受体的表达变化及意义[J];医学研究生学报;2007年11期

2 ;发现休眠卵巢癌细胞存活机制[J];生命世界;2009年02期

3 ;美发现休眠卵巢癌细胞存活机制[J];医学研究杂志;2009年04期

4 向君彦;夏新蜀;王昕娜;徐静;王萍;江园;余和平;白定群;许川山;;低强度中频超声杀伤卵巢癌细胞的初步研究[J];激光杂志;2011年01期

5 陈韵仙;;下泌尿道切除作为卵巢癌细胞减少术的一部分[J];国外医学.妇产科学分册;1983年03期

6 仲任,黄瑞滨,宋善俊;组织因子途径抑制物2对卵巢癌细胞迁徙和浸润能力的影响[J];癌症;2003年10期

7 ;精液能够杀死卵巢癌细胞[J];发明与创新;2003年12期

8 高琨,李力,陈心秋,张玮;雌孕激素对卵巢癌细胞体外生长的影响[J];肿瘤防治研究;2004年04期

9 王威廉,陈心秋,恩帝安,马加萨,周德南,唐凯,黄薇;抗卵巢癌细胞膜抗体对卵巢癌细胞体外细胞毒性试验及荷瘤小鼠的体内聚集性的实验研究[J];广西医科大学学报;2004年04期

10 仲任,黄瑞滨,宋善俊;组织因子途径抑制物2表达抑制卵巢癌细胞浸润能力的实验研究[J];肿瘤;2004年05期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 王文霞;孔北华;李鹏;曲迅;;蛋白酶体抑制剂对卵巢癌细胞的作用机制[A];第八次全国妇产科学学术会议论文汇编[C];2004年

2 刘娟娟;林蓓;赵越;李飞飞;郝莹莹;张帆;朱连成;张淑兰;;岩藻糖基化抗原对卵巢癌细胞生物学行为的影响[A];东北三省第四届妇产科学术会议论文汇编[C];2008年

3 陈心秋;王威廉;赵芳芳;周德南;唐凯;;~(131)Ⅰ—抗卵巢癌抗体联合外放射对卵巢癌细胞的体外杀伤实验研究[A];第七届广西肿瘤学术年会论文汇编[C];2003年

4 王威廉;陈心秋;恩帝安.马加萨;周德南;唐凯;;抗卵巢癌抗体对卵巢癌细胞体外细胞毒及载瘤裸鼠体内聚集性实验研究[A];第七届广西肿瘤学术年会论文汇编[C];2003年

5 许沈华;牟瀚舟;顾琳慧;朱赤红;刘祥麟;;高转移卵巢癌细胞差异表达基因在染色体定位及其功能[A];浙江省生理科学会2006年学术年会论文汇编[C];2006年

6 唐东平;陈心秋;唐凯;张洁清;贺海平;;11种化疗药物对卵巢癌细胞的抑制作用及其有核细胞细胞毒性研究[A];第四届中国肿瘤学术大会暨第五届海峡两岸肿瘤学术会议论文集[C];2006年

7 李晓峰;王欣;马开东;刘宝林;;卵巢癌细胞的低温保存及致死特性研究[A];上海市制冷学会2007年学术年会论文集[C];2007年

8 梁念慈;何太平;覃燕梅;吴科锋;;抗癌草药半边旗有效成分对卵巢癌细胞基因表达的影响[A];第十届全国生化与分子药理学术会议论文摘要汇编[C];2007年

9 郝莹莹;林蓓;赵越;欧阳玲;张淑兰;;α1,2岩藻糖转移酶基因转染对卵巢癌细胞生物学行为的影响[A];中华医学会第九次全国妇科肿瘤学术会议论文汇编[C];2006年

10 李长东;张为远;苑春莉;韩丽英;;卵巢癌细胞对人树突状细胞成熟及功能的影响[A];中华医学会第一届全球华人妇产科学术大会暨第三次全国妇产科中青年医师学术会议论文汇编[C];2007年

中国重要报纸全文数据库 前4条

1 记者 任海军;卵巢癌为何常常复活？生死命悬一基因[N];新华每日电讯;2009年

2 靖九江;4-HPR有望用于治疗卵巢癌[N];中国医药报;2005年

3 邰 举;韩国医学专家发现精液能够杀死卵巢癌细胞[N];中国中医药报;2003年

4 邰举;精液能够杀死卵巢癌细胞[N];科技日报;2003年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 王萍;丙泊酚对卵巢癌细胞侵袭和紫杉醇诱导的卵巢癌细胞凋亡的作用中转录因子Slug的影响[D];山东大学;2015年

2 魏星;CGI-58基因调控脂代谢介导卵巢癌细胞侵袭转移的作用及机制研究[D];第三军医大学;2015年

3 李晓;卵巢癌细胞影响外周血T淋巴细胞功能和分化的研究[D];浙江大学;2006年

4 彭萍;白细胞介素12基因转染树突状细胞后和卵巢癌细胞融合作为卵巢癌肿瘤疫苗的初步研究[D];中国协和医科大学;2003年

5 张晶晶;卵巢癌细胞与腹膜间皮细胞相互作用对侵袭转移微环境的影响[D];山东大学;2006年

6 李慧慧;雌激素及其代谢物和抗坏血酸对卵巢癌细胞的作用及相互影响[D];山东大学;2013年

7 李留霞;基因调控溶血磷脂酸作用通路抑制卵巢癌细胞生长的实验研究[D];郑州大学;2008年

8 黄妍;卵泡刺激素对卵巢癌细胞生物学行为的影响及其相关分子机制[D];复旦大学;2009年

9 刘颖涛;Rab25对卵巢癌的促进作用及其分子调节机制[D];复旦大学;2010年

10 李琴华;制瘤素对卵巢癌细胞的影响及其机制的体外研究[D];吉林大学;2011年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 曾丽;AKT2通过PKM2调控卵巢癌细胞增殖作用的研究[D];福建医科大学;2015年

2 雷婧;SDF-1激活PI3K-Akt通路在卵巢癌细胞增殖和侵袭中的作用[D];郑州大学;2015年

3 牛贝贝;GDF15对卵巢癌细胞迁移、增殖的影响及其可能机制[D];河北医科大学;2015年

4 陈燕;卡铂与吉西他滨单独或联合用药对卵巢癌细胞SKOV3及裸鼠皮下移植肿瘤生长抑制作用的研究[D];苏州大学;2015年

5 李钊;应用叶酸受体靶向} 米载体增强卵巢癌细胞光动力杀伤的实验研究[D];山东大学;2015年

6 刘瑞寒;塞来昔布诱导卵巢癌细胞发生上皮间质转化的作用及其机制研究[D];山东大学;2015年

7 侯栋;PARP1在卵巢癌的表达及抗氧化作用研究[D];山东大学;2015年

8 周静;PADI4基因对不同p53状态的卵巢癌细胞系生长及转移的影响[D];山东大学;2015年

9 林怡君;桦木酸诱导卵巢癌细胞CA0V3凋亡机制的研究[D];延边大学;2015年

10 姜霞;miR-182对瘦素诱导的卵巢癌细胞生长的影响及调控机制[D];第四军医大学;2015年

，

本文编号：872817