MicroRNA-204介导上皮性卵巢癌细胞抗失巢凋亡的实验研究

发布时间：2017-09-18 23:23

  本文关键词：MicroRNA-204介导上皮性卵巢癌细胞抗失巢凋亡的实验研究

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【摘要】：目的上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer,EOC)病变隐匿不易早期发现且病情发展迅速,居女性生殖道恶性肿瘤死因的首位。远处转移和化疗耐药是其主要生物学特征。抗失巢凋亡是卵巢癌转移和化疗耐药的重要机制之一。卵巢癌中Trk B/BDNF通过激活下游的PI3K/AKT细胞存活通路发挥抗失巢凋亡作用。针对卵巢癌细胞抗失巢凋亡的研究已有数年,最近micro RNAs在卵巢癌中的研究成为热点。经过筛选EOC组织中异常表达的micro RNAs,发现位于9号染色体上的mi R-204基因表达缺失,mi R-204在胃癌、子宫内膜癌、卵巢癌中作为抑癌因子,可抑制其侵袭和转移。生物信息学软件预测BDNF为mi R-204的靶基因之一。目前尚且缺乏mi R-204在EOC失巢凋亡中作用的研究。本研究目的在于:①探究mi R-204在EOC抗失巢凋亡中的作用;②探求mi R-204在上皮性卵巢癌细胞抗失巢凋亡中可能的作用机制。方法1选用SKOV-3、HO-8910细胞株,贴壁培养模拟卵巢癌原发灶细胞的生长状态,称为贴壁培养组,建立失巢凋亡模型筛选出具有失巢凋亡抗性的细胞以模拟卵巢癌转移灶细胞的生长状态,称为失巢凋亡组;荧光定量PCR检测SKOV-3、HO-8910细胞在贴壁生长和悬浮生长状态下mi R-204表达水平;2选择第一部分实验筛选出的具有抗失巢凋亡表型的HO-8910细胞,转染指示剂检测HO-8910细胞转染效率,构建pre-mi R-204质粒,转染HO-8910细胞。荧光定量PCR检测mi R-204表达;3建立失巢凋亡模型,流式细胞术检测细胞凋亡率;4应用体外侵袭模型,检测细胞的侵袭能力;5应用划痕实验检测细胞迁移能力;6应用荧光定量PCR法,检测细胞BDNF m RNA表达水平;7 Western blotting检测p AKT和总AKT蛋白表达水平。结果1失巢凋亡模型组中细胞呈悬浮状态、团簇状生长,模型构建成功;失巢凋亡模型组较贴壁培养组mi R-204含量显著降低,SKOV-3细胞在贴壁培养组和失巢凋亡组中的数值分别为1±0.0082和0.7283±0.0082,HO-8910细胞在两组中的数值分别为0.6242±0.0024和0.2577±0.0112,差异有统计学意义(P0.05);2检测HO-8910细胞转染效率为90%,测序报告显示重组质粒构建成功,转染后mi R-204质粒组mi R-204含量为10.1±0.016,较其余3个对照组增高(P0.05);空白对照组、转染试剂组、mi R-204 NC组中的mi R-204 m RNA含量依次为1±0.0039、1.07±0.014、0.929±0.011,差异均无统计学意义(P0.05);3失巢凋亡模型中细胞呈团簇状悬浮生长;流式细胞分析术结果显示mi R-204质粒组凋亡率为73.22±0.70,较其余3个对照组凋亡率增加(P0.05);阴性对照组、转染试剂组、mi R-204NC组中细胞凋亡率依次为48.98±0.55、45.16±0.49、54.46±0.62,差异均无统计学意义(P0.05);4建立细胞体外侵袭模型,结果显示mi R-204质粒组中透膜细胞数为86±4.5789,较其余3个对照组减少(P0.05);阴性对照组、转染试剂组、mi R-204NC组中透膜细胞数依次为153±15.4973、150±14.1480、140±6.0800,(P0.05);mi R-204质粒组卵巢癌细胞侵袭能力降低,差异有统计学意义。5划痕实验结果显示mi R-204质粒组中24h迁移距离为7.3±0.126,较其余3个对照组减少(P0.05);空白对照组、转染试剂组、mi R-204 NC组细胞迁移距离依次为11.2±0.276、12.5±0.228、10.4±0.335差异均无统计学意义(P0.05)。mi R-204质粒组中48h迁移距离为10.5±0.252,较其余3个对照组减少(P0.05);3个对照组细胞迁移距离依次为20.3±0.289、19.2±0.288、20.6±0276差异均无统计学意义(P0.05);mi R-204质粒组卵巢癌细胞迁移能力下降。6荧光定量PCR检测BDNF m RNA表达水平,结果显示mi R-204质粒组BDNF m RNA为0.22±0.0098,较其余3个对照组降低(P0.05);阴性对照组、转染试剂组、mi R-204NC组BDNF m RNA依次为1±0.0060、1.06±0.0139、0.96±0.0098,差异均无统计学意义(P0.05);mi R-204质粒组卵巢癌细胞BDNF m RNA水平降低,差异有统计学意义。7取p AKT/总AKT值表示AKT磷酸化水平。结果显示mi R-204质粒组中p AKT/总AKT值为0.068±0.028,较其余3个对照组降低(P0.05);空白对照组、转染试剂组、mi R-204 NC组p AKT/总AKT值依次为0.159±0.046、0.175±0.037、0.164±0.051,差异均无统计学意义(P0.05);mi R-204质粒组卵巢癌细胞p AKT磷酸化水平降低。结论1 mi R-204介导了上皮性卵巢癌细胞抗失巢凋亡;2 mi R-204可能通过Trk B/BDNF-PI3K/AKT通路介导上皮性卵巢癌细胞抗失巢凋亡。
【关键词】：miR-204 上皮性卵巢癌 失巢凋亡 BDNF 磷酸化AKT
【学位授予单位】：华北理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.31
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 引言11-13
• 第1章 miR-204介导上皮性卵巢癌细胞抗失巢凋亡13-39
• 1.1 实验材料13-15
• 1.1.1 实验仪器13-14
• 1.1.2 实验试剂14-15
• 1.2 实验方法及步骤15-23
• 1.2.1 细胞培养15-16
• 1.2.2 失巢凋亡模型的建立16-17
• 1.2.3 荧光定量PCR检测细胞的miR-204表达水平17-18
• 1.2.4 pcDNA3.1(+)/ pre-miR-204质粒的构建18-20
• 1.2.5 检测HO-8910卵巢癌细胞转染效率20-21
• 1.2.6 细胞转染21
• 1.2.7 转染后构建失巢凋亡模型21-22
• 1.2.8 FACS检测4组细胞凋亡率22
• 1.2.9 体外侵袭模型检测4组细胞的侵袭能力22
• 1.2.10划痕实验检测4组细胞的迁移能力22-23
• 1.2.11统计学分析23
• 1.3 结果23-35
• 1.3.1 SKOV-3、HO-8910贴壁生长和失巢凋亡状态下细胞形态23
• 1.3.2 SKOV-3、HO-8910贴壁生长和失巢凋亡状态下miR-204表达水平存在差异性23-26
• 1.3.3 riboTRACERTM转染指示剂检测HO-8910细胞转染效率26
• 1.3.4 构建pre-miR-204质粒及转染HO-8910细胞后miR-204表达情况26-30
• 1.3.5 上调HO-8910细胞miR-204表达后失巢凋亡率(%)增加30-32
• 1.3.6 上调miR-204后HO-8910细胞侵袭和转移能力降低32-35
• 1.4 讨论35-37
• 1.5 小结37-39
• 第2章 上调miR-204表达对上皮性卵巢癌细胞BDNF表达及AKT磷酸化的作用39-48
• 2.1 实验材料39-40
• 2.1.1 实验仪器39
• 2.1.2 实验试剂39-40
• 2.2 实验方法及步骤40-43
• 2.2.1 生物信息学预测40
• 2.2.2 转染后荧光定量PCR检测BDNF mRNA水平表达情况40-42
• 2.2.3 Western Blot检测4组细胞中AKT蛋白的磷酸化水平42
• 2.2.4 统计学分析42-43
• 2.3 结果43-47
• 2.3.1 上调miR-204对上皮性卵巢癌细胞BDNF mRNA表达的作用43-45
• 2.3.2 上调miR-204对上皮性卵巢癌细胞AKT磷酸化的作用45-47
• 2.4 讨论47-48
• 2.5 小结48
• 参考文献48-55
• 综述 MicroRNAs介导上皮性卵巢癌细胞抗失巢凋亡的研究进展55-62
• 3.1 抗失巢凋亡与卵巢癌55-57
• 3.1.1 外源性受体途径55
• 3.1.2 内源性途径55-56
• 3.1.3 细胞间连接异常56
• 3.1.4 EMT56-57
• 3.2 miRNAs与抗失巢凋亡57-58
• 3.3 miRNAs与卵巢癌58-59
• 3.3.1 miRNAs与卵巢癌侵袭转移58
• 3.3.2 miRNAs与卵巢癌耐药58-59
• 3.4 结语和展望59
• 参考文献59-62
• 结论62-63
• 致谢63-64
• 导师简介64-65
• 作者简介65-67
• 学位论文数据集67

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 董玉玮,侯进慧,朱必才,李培青,庞永红;表观遗传学的相关概念和研究进展[J];生物学杂志;2005年01期

2 苏立新;张陈平;胡永杰;曲行舟;刘浏;李思毅;;BDNF对唾液腺腺样囊性癌细胞株抗失巢凋亡能力和转移的影响[J];中国口腔颌面外科杂志;2007年03期

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本文编号：878133