脂肪源性干细胞和成纤维细胞联合移植治疗大鼠压力性尿失禁的实验研究

发布时间：2017-09-20 05:35

  本文关键词：脂肪源性干细胞和成纤维细胞联合移植治疗大鼠压力性尿失禁的实验研究

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【摘要】：目的:1.体外分离培养大鼠脂肪源性干细胞(Adipose-derived stromal cells,ADSCs)和成纤维细胞;2.建立压力性尿失禁(Stress urinary incontinence,SUI)模型,观察不同数量的异体ADSCs和成纤维细胞联合移植于尿道中段周围后对尿动力学指标的影响及细胞注射后尿道及周围组织的形态学变化,比较各组对压力性尿失禁的治疗效果。方法:1.采用胶原酶I分离提取大鼠ADSCs,经流式细胞仪对表面标志物进行鉴定;采用改良式两步酶消化法获取成纤维细胞,用免疫组织化学法将其鉴定;根据不同细胞群贴壁能力的差异使用差速贴壁离心法使两者纯化;利用倒置相差显微镜观察细胞的增殖情况及形态学变化,为后续实验提供理想的细胞源。2.36只SD雌性未孕大鼠随机分为两组:正常组6只,未造模且未行注射治疗;实验组30只进行阴道持续扩张和双侧卵巢切除术,2周后所有大鼠均用BL-420生物机能检测仪测定最大膀胱容量和腹压漏尿点压力,验证模型均建立成功。3.将造模成功后1个月的所有实验组大鼠又随机分为5组(6只/组)。在显微镜下将40u L的细胞数量分别为1×104、1×105、1×106的ADSCs和成纤维细胞混悬液分别移植于大鼠尿道中段周围的3点和9点处,而生理盐水作为对照组,并设立空白组,术后1个月进行尿动力学指标检测,评估对压力性尿失禁的治疗效果。4.细胞移植1个月后处死大鼠,将尿道及阴道前壁组织进行取材,采用HE染色评价细胞移植后尿道周围组织病理变化。5.统计学方法:采用SPSS 13.0进行数据处理,计量资料采用x±s表示。若数据符合正态分布和方差齐时,组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD-t法;不满足则采用秩和检验。以α=0.05为检验水准。结果:1.体外培养的ADSCs呈多角形或梭形的漩涡状细胞集落,形态均一,细胞表达CD29、CD44,不表达CD45,阳性率分别为96.63%、78.53%和0.75%。体外培养的成纤维细胞与ADSCs形态相似,经免疫组化鉴定,波形蛋白表达阳性,定位于胞质,而角蛋白表达阴性。经倒置相差显微镜观察,大鼠ADSCs和成纤维细胞经第三次传代后,细胞形态无明显变化,仍保持较强的分裂增殖活力。2.阴道持续扩张加双侧卵巢切除能够成功建立SUI动物模型。实验组与正常组的最大膀胱容量(ml)分别为1.83±0.54、3.08±0.28,腹压漏尿点压力(cm H2O)为76.02±2.56、24.91±2.94,实验组较正常组明显降低(P0.001)。3.将不同数量的ADSCs和成纤维细胞联合移植1个月后,经尿动力学检测,正常组、SUI组、生理盐水组、1×104组、1×105组、1×106组最大膀胱容量(ml)分别为3.08±0.28、1.89±0.36、1.93±0.60、2.10±0.55、2.23±0.66和2.54±0.38,组间比较示:正常组与其余各组均有统计学差异(P0.001),1×106组与SUI组、生理盐水组比较有差异,其余各组间比较均无差异(P0.05);各组腹压漏尿点压力(cm H2O)分别为76.02±2.56、26.26±3.01、29.17±4.09、32.96±4.99、36.82±4.22和41.16±3.57,组间比较示:正常组与其余各组均有差异(P0.001),但SUI组与生理盐水组无差异(P0.05),1×104组与SUI组有差异,1×105组与SUI组、生理盐水组有差异,1×106组与SUI组、生理盐水组和1×104组均有差异(P0.001)。4.不同数量的ADSCs和成纤维细胞联合移植后各组尿道及周围组织的形态学变化:正常组尿道有完整的肌层结构,肌纤维呈束状紧密排列。SUI组尿道肌层受损,排列紊乱并变薄,且肌纤维之间出现松散、断裂及萎缩现象。而生理盐水组无明显变化,但尿道形成瘢痕及纤维化。细胞移植组,移植局部尿道肌层明显增厚(P0.01),肌纤维排列仍相对松散和紊乱,周围结缔组织变紧密,但是细胞各数量级间未见明显差异(P0.05)。正常组阴道前壁可见清晰的粘膜层、肌层和外膜层结构,平滑肌束粗大,呈编织状,胶原含量丰富、致密。SUI组肌层较薄,面积变小,肌纤维之间失去正常的连接结构,肌束间隙增宽,胶原纤维散在分布且出现断裂现象。生理盐水组和细胞移植组均未见明显变化(P0.05)。结论:1.通过差速贴壁法和胶原酶消化法可获得纯度较高、生物活性较好的脂肪源性干细胞;采用差速贴壁结合改良式两步酶消化法,可获得纯度较高的成纤维细胞。2.脂肪源性干细胞和成纤维细胞联合移植以1×106/只可能是治疗大鼠压力性尿失禁较佳的浓度选择。
【关键词】：压力性尿失禁 脂肪源性干细胞 成纤维细胞 动物模型 移植治疗
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R711.59
【目录】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 常用缩写词中英文对照表13-14
• 前言14-16
• 第一部分16-27
• 1 材料与方法16-21
• 1.1 实验动物16
• 1.2 实验设备与试剂16-18
• 1.3 实验方法18-21
• 2 结果21-24
• 2.1 原代培养过程中ADSCs的形态变化21
• 2.2 传代后ADSCs细胞形态变化21-22
• 2.3 大鼠ADSCs表面标记物鉴定22-23
• 2.4 原代成纤维细胞的生长情况23
• 2.5 成纤维细胞免疫组化染色结果23-24
• 3 讨论24-27
• 第二部分27-42
• 1 材料与方法27-32
• 1.1 实验动物27
• 1.2 实验设备27
• 1.3 HE染色所需设备及试剂27-28
• 1.4 实验方法28-31
• 1.5 统计学方法31-32
• 2 结果32-38
• 2.1 实验动物体重比较32
• 2.2 各组尿动力学指标比较32-33
• 2.3 细胞移植1月后各组尿动力学指标比较33-34
• 2.4 各组大鼠尿道中段HE及Masson染色结果34-36
• 2.5 各组大鼠阴道前壁HE染色结果36-38
• 3 讨论38-42
• 结论42-43
• 参考文献43-49
• 综述49-58
• 参考文献55-58
• 致谢58-59
• 在学期间承担/参与的科研课题与研究成果59-60
• 个人简历60

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 丁文娟;洪莎莎;闵洁;方桂;张小红;胡鸣;杨青;赵杨;洪莉;;人子宫旁韧带成纤维细胞原代培养的初步研究[J];武汉大学学报(医学版);2014年01期

2 秦义武;赵劲民;苏伟;李晓峰;刘伟;;大鼠脂肪源性干细胞的分离培养及鉴定[J];中国组织工程研究与临床康复;2011年23期

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本文编号：886225