人附睾分泌蛋白4和癌抗原125光激化学发光免疫分析试剂的研制

发布时间：2017-10-03 04:12

  本文关键词：人附睾分泌蛋白4和癌抗原125光激化学发光免疫分析试剂的研制

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【摘要】：研究背景及目的卵巢癌在妇科肿瘤中发病率仅次于宫颈癌和子宫体癌居第三位,而其致死率却占首位。卵巢癌是严重威胁妇女健康的恶性肿瘤,其发生、发展较为隐匿,由于卵巢癌早期无症状,缺乏有效的筛查手段,临床上80%的卵巢癌患者获得诊断时已是中晚期,其5年存活率仅为20%～30%,而早期卵巢癌患者5年生存率为70%～90%。卵巢癌早期预后极好,但晚期只有10%～30%的存活率。因此,早期发现对卵巢癌患者非常重要。高灵敏度与高特异度的卵巢标致物有助于卵巢癌的早期发现,无疑也将提高卵巢癌的生存率,同时也有助于治疗中的病情监测、疗效评价及预后判断。人附睾分泌蛋白4(HE4)是一种新的、有潜力的卵巢癌标志物,在卵巢癌的早期诊断及疾病监测方面具有良好的应用前景。HE4属于乳清酸性4--硫化中心(WFDC)蛋白家族,全长11.78kb。HE4基因最早在人附睾上皮细胞中发现,通过cDNA微阵列分析发现HE4基因与卵巢癌有关。这一新的血清标记物在良性肿瘤患者及正常人血清中含量极低,但在卵巢癌患者血清中含量很高。而日益增多的研究证据表明,HE4在卵巢癌的早期诊断及疾病监测方面具有良好的应用前景。癌抗原125(CA125)自卵巢浆液囊腺癌中提取,是相对分子质量为2×105～10×105的糖蛋白抗原。其在上皮性卵巢癌细胞中CA125高度表达,并且能分泌到血液中。CA125是目前临床应用最广的卵巢癌肿瘤标志物,主要用于卵巢癌的辅助诊断,同时也作为卵巢癌治疗后疗效观察的指标和监测病情的手段,临床实用价值较高。尽管大多数卵巢癌患者血清CA125水平升高,但在这些患者中也仅有不到50%的人在疾病的早期升高。虽然CA125具有较高敏感性,但很多妇科良性疾病患者血清CA125都会明显升高,而且不能区分CA125在生理情况(月经期、妊娠期)和一些良性疾病(子宫内膜异位症、卵巢囊肿、伴有腹水的肝硬化等)的升高。研究证实,HE4在卵巢癌组织的表达明显高于卵巢正常组织,与以往所使用的标志物相比,HE4在卵巢癌的诊断中具有很高的敏感性,尤其是在卵巢癌的I期诊断方面。而联合检测血清中HE4与CA125的水平得到的灵敏度比单独使用两者中的任何一个都高。标记免疫学,就是将标记技术和免疫学技术相结合进行分析测定的一门学科,是集实验技术、基础医学和临床应用于一体的学科,其基本原理是利用抗原抗体反应的高度特异性和各标记物的高灵敏可测量性来检查体内各种生物活性物质的活性和浓度。随着标记技术、单克隆抗体技术和分子生物学技术的不断发展与完善,标记免疫学已广泛应用于医学检验、农药残留、环境污染及食品安全检测等多个领域。目前该方法包括一系列的免疫分析技术：荧光免疫分析(FIA)、酶免疫分析(EIA)、放射免疫分析(RIA)、胶体金免疫分析(GICA)、时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)、化学发光免疫分析(CLIA)等。但这些传统标记免疫学技术在应用中存在着一些不足。因此,开发新型标记免疫技术非常有必要,一种新型定量免疫分析技术光激化学发光免疫分析(Amplified luminescent proximity homogenous immunoassay, AlphaLISA)技术应运而生。该技术起源于1994年发明的单线态氧分子能量传递发光免疫分析技术(Luminescent oxygen channeling immunoassay, LOCI),随后美国PerkinElmer公司研制相关科研试剂(AlphaScreen(?))。作为近年兴起的新型定量均相免疫学检测技术,它克服了传统标记免疫学技术需洗涤分离结合标记与游离标记的缺点。它结合单线态氧半衰期短、纳米材料和激光技术等优势,实现了在均相中进行反应的操作过程。光激化学发光免疫分析技术具有操作简单、背景信号低、检测重复性好、无放射性污染、不需分离结合标记与游离标记、高通量、易于自动化和高灵敏度等优势,代表了现在及未来分析检测技术的发展趋势。本研究采用光激化学发光免疫分析(AlphaLISA)技术研制HE4和CA125检测试剂并评价各项性能指标,同时与其它检测试剂盒进行比较,评价其在临床检测应用中的可行性。方法：采用双抗体夹心法研制人附睾分泌蛋白4和癌抗原125光激化学发光免疫分析试剂。1.受体微球与抗体连接将0.2 mg包被抗体加入到带有滤膜的离心管中,以5510 g离心5～6 min,用标记缓冲液(0.13 mol/L, pH 8.0 PBS)重复洗涤6次后,在抗体溶液中加入1 mg受体微球、10 pL 25 mg/mL NaBH3CN(用标记缓冲液配制)、1.25 μL 10% Tween-20,用标记缓冲液将体积补充到200 μL,37-C避光振荡反应48 h。加入10 μL 65 mg/mL CMO(用0.8 mol/L NaOH配制)封闭未结合位点,37℃避光温育1 h后离心洗涤,得到已连接抗体的受体微球,调整受体微球浓度为5 mg/mL。2.生物素与抗体连接将0.5 mg标记抗体加入到带有滤膜的离心管中,以5510g离心5～6 min。用标记缓冲液(0.1 mol/L Na2CO3/NaHCO3, pH 9.5)重复洗涤6次后,在50μL抗体溶液中加入5 μL 20 mg/mL活化生物素[用二甲亚砜(DMSO)配制],室温避光振动孵育4 h。利用PBS (pH7.4)4"C透析24 h,每6 h换液一次,收集透析袋中液体,并将其抗体浓度调整为0.5 mg/mL。3.参考标准品的配备用标准品缓冲液(50 mmol/L Tris-HCl、7.5% BSA、 0.9%NaCl、0.05% NaN3、0.01% Tween-20, pH7.8)将抗原配制成所需系列浓度,每瓶1ml分装冻干4℃保存备用。4.试剂性能指标的评价4.1标准曲线的绘制：以自制试剂中参考标准品浓度为横坐标,信号值为纵坐标,由双对数数学模型Log-Log函数处理。4.2 Hook效应：对浓度递增的多个参考标准品抗原进行测定。4.3分析灵敏度：将零值参考标准品当作样品测量20次,计算其均值及标准差。以其测定值的均值加上2倍标准差所得信号值减去本底信号值,代入标准曲线方程计算所得出的浓度,即为其灵敏度。4.4准确度实验：使用阴性血清将HE4抗原稀释作为参考样品,并以自制标准品的实测浓度与理论浓度的比值在0.90-1.10之间作为评价准确性合格的标准。4.5精密度实验：采用低、中、高3个质控品(质控品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)进行测定,得到各质控品检测值的均数、标准差及变异系数(CV)。4.6特异性实验：将一定浓度的干扰物质作为样本检测得到的相应浓度即为特异性。4.7回收率实验：在已知浓度的血清样本中添加不同浓度的纯抗原,计算其理论值及实测值的比值,即回收率。4.8干扰实验：对加入了血红蛋白、甘油三酯和胆红素的阳性标本进行测定,计算其回收率。4.9与国外试剂的比较实验：样本用自制试剂与对照试剂检测后将所测浓度值进行相关性分析。结果：自制HE4试剂分析灵敏度为0.81 pmol/L,线性范围内,HE4剂量-反应曲线线性相关系数,r2=0.996；稀释回收率在93%-103%之间；分析内和分析间的精密度分别为4.3%-7.2%和6.1%-7.7%,均低于10%；HE4试剂与CA15-3、AFP、CEA和CA125无交叉反应。HE4试剂不受血红蛋白、甘油三酯、胆红素的干扰； 134例临床血清样本用本试剂与罗氏电化学发光检测试剂盒平行检测,进行相关性分析,相关性良好(,=0.978,P0.0001)。表明本研究研制的试剂有望取代的进口检测试剂盒用于临床检测和基础医学研究。自制CA125试剂灵敏度为0.43 U/mL；精密度实验显示自制试剂分析内分析间变异系数均低于10%,显示该系统的精密度较高。特异性结果显示与CA15-3、AFP、CEA、HE4、CA19-9和CA50无明显交叉反应,可见采用的两株单克隆抗体特异性好。161份临床血清样本用本试剂与罗氏电化学发光检测试剂盒平行检测,结果显示两种方法测得的数值统计学相关性良好(r2=0.992,P0.0001),表明本研究研制的试剂有望取代的进口检测试剂盒用于临床检测和基础医学研究。结论：上述结果表明本研究研制的人附睾分泌蛋白4和癌抗原125光激化学发光免疫分析试剂的各项指标(准确性、灵敏度、精密度、特异性等)均达到临床检测试剂要求,有望替代国外昂贵试剂应用于临床检测和基础医学的研究。正如文献报道人附睾分泌蛋白4和癌抗原125在联合使用时所展示出来的独特优势,我们期待自制人附睾分泌蛋白4和癌抗原125光激化学发光免疫分析试剂可以联合应用于卵巢癌的诊断与鉴别诊断、病情监测及疗效评价。
【关键词】：光激化学发光免疫分析 人附睾分泌蛋白4 癌抗原125
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.31
【目录】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-16
• 前言16-28
• 第一章 人附睾分泌蛋白4光激化学发光免疫分析试剂的研制28-43
• 1.1 材料28-30
• 1.2 方法30-36
• 1.3 结果36-40
• 1.4 讨论40-42
• 1.5 结论42-43
• 第二章 癌抗原125光激化学发光免疫分析试剂的研制43-55
• 2.1 材料43
• 2.2 方法43-47
• 2.3 结果47-52
• 2.4 讨论52-54
• 2.5 结论54-55
• 参考文献55-60
• 中英文缩略词60-62
• 硕士期间论文发表情况62-63
• 致谢63-64

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本文编号：963080