可溶性Tim-3在疾病中的表达及其意义的研究

发布时间：2017-11-29 19:14

  本文关键词：可溶性Tim-3在疾病中的表达及其意义的研究

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【摘要】：背景:我们的机体在受到损伤或刺激时,会保护性的产生免疫及炎症反应。适当的免疫及炎症反应有利于健康的维持,自身稳态的恢复,而当机体发生免疫及炎症应答过强或持续时间过长,免疫监视功能低下,免疫耐受被打破等情况,就会造成机体组织损伤,导致功能异常,乃至引发肿瘤及自身免疫性疾病等的发生。因此及时监测、评估免疫及炎症反应的变化对于健康的维持及疾病的恢复具有重要意义。在机体组织、器官损伤或是功能异常的情况下,体内随之就会产生一些“标志物”,人们将这些标志物用于评价体内的免疫及炎症反应或代谢状态,为疾病的诊治提供了有力的手段。例如:在急性炎症期,机体会因为IL-6等细胞因子的刺激,诱导肝细胞合成大量C反应蛋白(C-reactive Protein,CRP);自身免疫疾病患者血清中会因为抗原-抗体复合物在体内蓄积,检测到针对自身抗原的抗核抗体(Antinuclear antibody,ANA);糖尿病患者会因为胰岛素抵抗或是分泌不足导致血糖异常升高;肾功能不全的患者由于肾脏泌尿功能减退或丧失,使代谢废物潴留,会造成患者血液中尿素、肌酐等显著升高。这些“标志物”是临床上对疾病诊断和病情评估的辅助手段,能客观地评价病情严重程度和疾病预后。随着科学的进步尤其是基础研究的深入,一些新的分子和蛋白被应用到临床,为临床提供新的治疗靶点和评估手段。T细胞免疫球蛋白及粘蛋白-3(T cell Immunoglobulin and mucin3,Tim-3)是一种起初表达于活化的Th1细胞上的免疫检查点分子,其配体为Galectin-9蛋白。Tim-3与其配体结合后可以通过诱导T细胞凋亡等机制负性调控免疫应答。后来有研究发现Tim-3也表达在巨噬细胞、DC等天然免疫细胞上。鉴于该分子在T细胞及天然免疫细胞上的高表达与多种免疫相关性疾病密切相关,Tim-3被视作一个潜在的抗感染、抗肿瘤免疫干预靶点,其发挥免疫调控的具体机制及应用近来越来越受到人们的重视。近来发现除了膜结合型外,Tim-3还存在可溶型蛋白的形式,即可溶性Tim-3(soluble Tim-3,s Tim-3),其可能的来源包括Tim-3基因的选择性拼接或细胞膜上的Tim-3蛋白的脱落。目前人们对于细胞膜上Tim-3的研究较多,认识比较深入,而对于体内可溶性Tim-3的来源及意义尚不清楚。目前认为可溶性Tim-3可以通过以下两种方式调节炎症及免疫反应:首先Tim-3的脱落使免疫细胞表面抑制性受体减少,提高免疫细胞活性;其次,可溶性Tim-3可以通过与细胞膜上的Tim-3竞争性结合其配体分子,阻断配体介导的抑制性信号,从而增强炎症及免疫反应。我们实验室近年来一直关注Tim-3调控机制的研究,研发了一系列的Tim-3抗体、融合蛋白等制剂,重点探讨了Tim-3对天然免疫的调控机制。鉴于我们发现Tim-3可溶性蛋白分子在调节免疫应答中的关键作用如促进巨噬细胞的活化及极化、增强免疫细胞中细胞因子的表达等,我们推测血清中可溶性Tim-3的表达变化可能与多种炎性疾病的进程相关,具有潜在的研究和应用价值。我们前期在临床血清样本中的检测结果也提示,可溶性Tim-3的表达变化可能与炎性疾病病情相关。尽管也有一些另外的报道提示可溶性Tim-3的临床价值,如报道显示移植排斥中可溶性Tim-3水平的升高预示着排斥反应的发生,但这方面的研究还不十分全面。因此在本研究中我们基于前期研究基础、利用临床资源,充分探讨可溶性Tim-3在不同疾病中的表达变化及其临床意义,期望为疾病的监测提供新的标志物分子。目的:综上所述,本论文的研究目的主要有以下几个方面:1.通过研究可溶性Tim-3在急性损伤、系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus,SLE)、慢性肾脏病(Chronic Kidney Diseases,CKD)、类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)、肿瘤等各种急慢性炎症患者血清中的表达水平,分析其在不同疾病中的表达有何不同,并分析可溶性Tim-3水平与CRP蛋白之间的关系;2.为了进一步研究可溶性Tim-3与疾病进展之间的关系,通过相关性分析明确慢性肾脏病患者、系统性红斑狼疮患者血清中可溶性Tim-3水平与病程进展之间的相关性,明确将其作为疾病监测标志物的可行性;3.初步阐明血清中可溶性Tim-3产生及影响炎症反应的机制,为今后的应用研究提供理论依据。方法与结果1、在不同疾病患者血清中可溶性Tim-3的表达变化及其与炎症反应的关系1.1可溶性Tim-3在不同疾病中的表达变化为了观察可溶性Tim-3在不同疾病中的表达有何不同,本实验收集2014年3月到2016年1月在我院住院的不同疾病患者188例,将其按诊断分为类风湿关节炎组(41例)、系统性红斑狼疮组(23例)、慢性肾脏病组(66例)、外伤组(17例)、糖尿病组(10例)、胃癌组(15例)、感染组(16例)、健康对照组(20例)。分别留取上述患者空腹血清及全血细胞,采用ELISA法检测血清中可溶性Tim-3的表达水平,采用PCR方法分析外周血细胞中Tim-3 m RNA的表达。结果发现:可溶性Tim-3在急性创伤患者中表达显著降低,在慢性炎症性疾病及肿瘤中的表达升高。在SLE患者血细胞中Tim-3 m RNA的变化水平与血清可溶性Tim-3蛋白水平一致。该结果提示可溶性Tim-3可以作为体内炎症反应状态的一个指标。1.2可溶性Tim-3与炎症指标CRP的对比分析CRP作为重要的急性时相反应蛋白,是反映炎症严重和组织损伤大小的一个重要指标,除了用于急性感染的监测,CRP在慢性疾病中对于评估慢性炎症性疾病活动度、心血管疾病的发病风险等方面中也具有重要的参考价值。在急性炎症阶段,我们研究发现CRP的升高与可溶性Tim-3的降低之间没有出现显著的相关性。在慢性炎症如SLE、CKD中CRP轻度升高,而此时可溶性Tim-3显著升高,提示在慢性炎症情况下可溶性Tim-3是一个比CRP更敏感、更具有潜在价值的指标。2、血清可溶性Tim-3水平在评价CKD患者和SLE患者疾病进展中的作用分析我们前面的实验发现可溶性Tim-3在一些慢性炎症中的表达显著升高。为了进一步探讨其临床意义,我们选择了免疫及炎症损伤相关的SLE及CKD作为研究对象,观察了可溶性Tim-3与病程的相关性。我们的结果表明:1)CKD患者血清可溶性Tim-3表达水平显著高于健康对照组,且可溶性Tim-3表达水平与肾功能损伤呈正相关,与肾小球滤过率评估值(e GFR)结果呈负相关,证实了可溶性Tim-3表达水平与肾病的疾病进展有相关性。另外还发现可溶性Tim-3与早期肾损伤检测指标β2微球蛋白(Beta2 microglobulin,β2-MG)相关,有望成为早期肾损伤的指标。(2)SLE患者血清中可溶性Tim-3表达水平与疾病严重程度如累及器官的多少、补体C3水平等指标存在相关。以上结果提示可溶性Tim-3可以作为监测上述两种疾病进展状态的新指标。3、可溶性Tim-3的产生及作用机制研究。如前所述,可溶性Tim-3的来源有两种即基因水平的表达升高和从细胞膜表面脱落的增加。我们在前面的研究发现SLE、CKD中可溶性Tim-3蛋白水平与Tim-3 m RNA水平同步升高,提示疾病中可溶性Tim-3表达的升高可能来源于基因水平的表达升高。而另一方面,近来的研究提示金属蛋白酶10(A Disintegrin and Metalloproteinase Domain 10,ADAM10)、金属蛋白酶17(A Disintegrin and Metalloproteinase Domain 17,ADAM17)等脱落酶可能参与了Tim-3从细胞膜上脱落的过程。因此为了证实患者中可溶性Tim-3的升高是否来源于细胞膜上的脱落,我们同时对患者中ADAM10、ADAM17两种酶的表达进行了同步分析,发现ADAM10、ADAM17表达水平与可溶性Tim-3的水平存在正相关关系,提示ADAM10、ADAM17表达引起的膜上Tim-3的脱落也是患者血清中可溶性Tim-3表达升高的原因之一。此外,我们还发现可溶性Tim-3蛋白可引起外周血中炎性小体相关的炎症介质包括白介素1β(Interleukin-1β,IL-1?)、白介素18(Interleukin-18,IL-18)等炎症介质表达的升高,部分解释了可溶性Tim-3引发炎症反应的机制。结论:1.可溶性Tim-3在急性损伤及慢性炎症中出现低表达及高表达两种截然不同的变化。在慢性炎症情况下可溶性Tim-3是一个比CRP更有潜在价值的指标。2.在慢性疾病CKD及SLE中,可溶性Tim-3在监测疾病进展方面显示出潜在的疾病监测诊断价值。3.可溶性Tim-3的来源可能同时存在基因表达升高及脱落增加两种方式,可溶性Tim-3的表达升高可能通过上调炎性小体相关分子等机制促进炎症反应。
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R363

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本文编号：1237820