硫化氢阴性沙门菌遗传变异规律及硫化氢参与沙门菌耐药机制的研究

发布时间：2018-01-09 00:21

本文关键词：硫化氢阴性沙门菌遗传变异规律及硫化氢参与沙门菌耐药机制的研究　出处：《中国人民解放军军事医学科学院》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：沙门菌是一种引起食源性腹泻的常见病原菌,可通过食物、水源进行传播,引发人类急性腹泻甚至死亡。通常,绝大多数沙门菌可以产生硫化氢(hydrogen sulfide,H_2S),因此,H_2S是实验人员初筛与鉴定沙门菌的重要生化指标。近几年H_2S阴性沙门菌在世界范围内不断涌现,尤其在我国,H_2S阴性沙门菌的流行更为普遍。沙门菌中,phs操纵子编码硫代硫酸盐还原酶,由phsA、phsB、phsC三段基因组成,是沙门菌产生H_2S的重要功能基因。研究指出,绝大部分的H_2S阴性沙门菌phsA基因发生了不同类型的突变,可能导致了沙门菌H_2S表型的缺失。此外,多重耐药(multi-drug resistance,MDR)沙门菌在全球多地涌现。值得注意的是,H_2S阴性沙门菌的耐药菌株也多次被研究人员检出。由此可见,沙门菌耐药问题日趋严重。已有研究指出,H_2S不仅是细菌硫代谢的副产物,还在细菌耐药过程中发挥重要作用。目前,已在大肠杆菌、沙门菌等多种细菌中证实了这一重要的生物学功能。这不仅表明气体分子作为一种新的耐药方式被人们所认知,而且还揭示了细菌耐药机制的复杂性。然而,H_2S作为新的耐药方式调控细菌耐药的分子机理却不得而知。基于全国沙门菌监测平台,本实验室于2006至2013年间共收集到的90株H_2S阴性沙门菌。本研究旨在通过对H_2S阴性沙门菌遗传变异规律的研究,揭示阴性菌与阳性菌之间的亲缘关系,为我国沙门菌防控策略的制订提供数据参考和科学依据;同时,探究H_2S参与调控沙门菌耐药背后可能的分子机制,为耐药菌的治疗提供新的靶点和思路,也为多重耐药沙门菌的治疗和防控提供依据。本研究通过细菌抗生素敏感实验,分析90株H_2S阴性沙门菌自身的耐药特点、各血清型的耐药差异以及其与H_2S阳性沙门菌在耐药表型上的不同,重点关注耐喹诺酮类药物的沙门菌及多重耐药菌株,为治疗沙门菌感染时合理选择抗生素提供重要科学依据。对21种抗生素敏感实验的结果表明,H_2S阴性沙门菌对氨苄西林、替卡西林、庆大霉素、复方新诺明、四环素及氯霉素的耐药率高于H_2S阳性沙门菌。而对于头孢类药物、亚胺硫霉素、阿米卡星和氨曲南,H_2S阴性与阳性沙门菌均表现出普遍的敏感性。90株H_2S阴性沙门菌中,有13株对喹诺酮类药物耐药或者中介耐药,检测发现这些菌株gyr A或par C基因上有关键位点突变。另外,相同血清型的H_2S阴阳菌株对同种类的抗生素耐药情况存在差异,包括猪霍乱沙门菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌。值得注意的是,在分离的14种不同血清型的H_2S阴性沙门菌中,猪霍乱沙门菌不仅耐药率最高,而且有76%的菌株为MDR菌株。脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)与多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)是研究细菌遗传与亲缘关系的常用方法。我们通过MLST分析将90株H_2S阴性沙门菌分为22种ST型别,其中包括两种新的ST型:ST1960和ST1961。H_2S阴性鸡沙门菌形成两个克隆群(clonal complex),CC92与CC1960,而其他血清型的H_2S阴性沙门菌分别形成一个CC。山夫登堡、猪霍乱、乙型副伤寒沙门菌的H_2S阴阳菌株分别属于不同的ST型。相比于H_2S阳性菌,阴性的肠炎、鼠伤寒沙门菌的ST型种类更多,而其它血清型的H_2S阴阳性菌株的ST型别相同。通过PFGE分析,47株H_2S阴性沙门菌与40株H_2S阳性沙门菌按照50%的相似度分为三个聚类组,其中肠炎、乙型副伤寒沙门菌H_2S阴阳性菌分别聚类在不同的聚类组中,说明H_2S阴性肠炎、乙型副伤寒沙门菌已经形成了不同于阳性菌的进化分支。鼠伤寒、德比、阿贡纳、汤伯逊和火鸡沙门菌的H_2S阴阳性菌株分别聚类在同一聚类组里,说明这些血清型的H_2S阴阳性菌株亲缘关系密切。分离于上海的H_2S阴性鸡沙门菌与分离于广州H_2S阴性肠炎沙门菌ST型相同、PFGE带型相似,另外分离于玉溪与上海的H_2S阴性甲型副伤寒沙门菌具有相同的ST型和PFGE带型,说明H_2S阴性沙门菌存在跨地区传播的可能。此外,分离于家畜的H_2S阴性德比、鼠伤寒沙门菌与同血清型的人源阳性菌PFGE带型相似、ST型相同;分离于水源与人源的H_2S阴性火鸡沙门菌PFGE带型与ST型完全相同,说明不同样本来源的沙门菌之间亲缘关系密切,提示我们应防范H_2S阴性沙门菌通过食物传播给人类或动物。我们利用PCR技术对H_2S阴性沙门菌的phs操纵子进行扩增并进行DNA测序,从基因水平揭示沙门菌H_2S表型缺失的原因。通过比对phs操纵子序列,发现77株(85%)H_2S阴性沙门菌phs基因具有多种突变类型,其中74株(82%)phsA基因发生了突变。phsA基因中主要有三种突变类型:第760位的移码突变、第1087位的移码突变以及第1624位的错义突变;在phsB基因中,主要有四种突变位点:第164位、第314位、第319位及第373位的错义突变;在phsC基因中,主要有两种突变类型:第577位的无义突变和第754位的错义突变。这些突变导致基因产物不完整或氨基酸序列改变,从而可能导致沙门菌失去产H_2S的能力。总体来说,H_2S阴性沙门菌的phs基因突变的多样性,表明H_2S阴性沙门菌phs操纵子序列具有不稳定性,但相同血清型之间phs基因序列趋于稳定。我们利用no-SCAR(Scarless Cas9 Assisted Recombineering)基因编辑技术,成功构建了phsA基因缺失的鼠伤寒沙门菌ATCC14028突变株(ΔphsA突变株)。经沙门/志贺琼脂培养基(SS琼脂)及醋酸铅试纸验证,野生株在SS琼脂上为黑色菌落,而ΔphsA突变株为无色菌落;野生株可使醋酸铅试纸明显变黑,但是ΔphsA突变株却不能。说明ΔphsA突变株无法利用培养基中的硫代硫酸盐产生H_2S,不能与指示剂反应生成黑色沉淀。在不同抗生素种类(诺氟沙星、庆大霉素、卡那霉素、四环素)及过氧化氢刺激下,通过对野生株与ΔphsA突变株生长曲线的检测,发现野生株的生长水平显著高于ΔphsA突变株,表明野生株可利用其产生的H_2S抵御抗生素的杀菌作用,从而耐药生长。在抗生素或过氧化氢刺激下,野生株内由氧化应激作用产生的ROS显著低于ΔphsA突变株,说明H_2S可通过抑制抗生素氧化应激过程中ROS的表达,发挥细菌保护作用,从而使细菌耐药生长。综上所述,本研究通过开展对H_2S阴性沙门菌抗生素耐药性及耐药机制研究,发现H_2S阴性沙门菌与H_2S阳性沙门菌耐药性的差异;对H_2S阴性沙门菌与H_2S阳性沙门菌的遗传多态性研究,首次发现了两种H_2S阴性沙门菌的ST型别,并且发现H_2S阴性沙门菌形成了与H_2S阳性沙门菌不同的进化分支;对H_2S参与沙门菌耐药机制的研究,发现H_2S可利用其还原性清除抗生素氧化应激反应产生的ROS,发挥细菌耐药作用。这些研究结果对于沙门菌感染引起疾病时合理使用抗生素、传染源溯源以及有效预防沙门菌传播有重要的科学依据,同时也为以H_2S分子作为潜在耐药靶点和细菌耐药的研究提供新的思路。
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【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R378

【参考文献】