4.1R基因缺失对IgE介导的肥大细胞活化的影响

发布时间：2018-01-15 08:15

本文关键词：4.1R基因缺失对IgE介导的肥大细胞活化的影响　出处：《郑州大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：研究背景肥大细胞来源于骨髓造血干细胞,其前体在定居的组织(皮肤、神经周围、肠粘膜、呼吸道粘膜等)器官中发育成熟。肥大细胞通过受体识别相关病原体,在机体抵抗病原微生物感染的固有免疫中发挥重要功能,其被活化后通过脱颗粒向周围组织释放组胺、细胞因子、趋化因子等炎性介质参与I型变态反应(过敏反应),还能够导致炎症后期的炎症细胞持续浸润、组织重构及纤维化,因此肥大细胞在过敏,炎症,免疫反应中都发挥着重要作用。肥大细胞的活化受细胞多种分子调控,FcεRI和KIT两个跨膜受体在肥大细胞活化信号起始阶段发挥关键作用。其中FcεRI在肥大细胞中高表达,是肥大细胞活化调控中主要的膜受体。当机体初次接触致敏原,B细胞产生的特异性抗体IgE可与肥大细胞表面的FcεRI结合,促使FcεRI发生交联,使机体处于致敏状态。当同一致敏原再次刺激时,可经IgE/FcεRI活化肥大细胞,最终引起颗粒内组胺的释放以及细胞因子的分泌,从而导致平滑肌收缩、毛细血管扩张、通透性增加,引起过敏反应。尽管对于肥大细胞活化的研究较多,但是针对参与肥大细胞活化关键分子的研究仍然是热点之一。鉴于肥大细胞在过敏反应中的关键作用,研究发现肥大细胞活化的新调控因子对探讨肥大细胞参与的过敏反应具有重要意义。蛋白4.1R是1979年在成熟红细胞中发现的80kDa细胞膜骨架蛋白分子。在红细胞中存在两种形式的蛋白4.1R:135kDa亚型(4.1R135)与80kDa亚型(4.1R80),分别表达于红细胞的不同分化阶段。4.1R是将红细胞跨膜蛋白和血影蛋白-肌动蛋白蛋白骨架网络连接起来的桥梁,对维持红细胞的形状、粘附、脆性及正常生理功能发挥重要作用。拥有FERM结构域的蛋白被称为蛋白4.1超家族,4.1超家族分为5个亚家族:4.1蛋白家族、ERM蛋白家族、踝蛋白相关分子、PTPH和NBL4蛋白。近年来研究发现,4.1蛋白家族除了最初在成熟红细胞中发现的80kDa的细胞膜骨架蛋白分子4.1R,还包括在有核细胞中广泛表达的4.1N、4.1G、4.1B,其中4.1N主要分布在神经系统,4.1B主要分布在脑组织,4.1G广泛分布,而4.1R则在红细胞及同样来源于骨髓多功能造血干细胞的T细胞、B细胞和肥大细胞等免疫细胞中高表达。本课题前期研究显示蛋白4.1R通过抑制T细胞受体TCR介导的信号转导对T淋巴细胞活化及增殖发挥负调控作用,同时实验组前期利用小鼠自身抗原MOG诱导小鼠实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)模型,发现4.1R基因敲除小鼠对致敏原反应更敏感。4.1R在不同细胞中的功能正在越来越多的被发现,但是4.1R在固有免疫细胞,如肥大细胞,巨噬细胞等中的功能尚不清楚。研究目的本研究利用课题组已建立的4.1R基因敲除小鼠模型,研究4.1R基因缺失对IgE介导的体外肥大细胞活化和体内过敏反应性疾病的影响,证实细胞膜骨架蛋白4.1R是肥大细胞活化的重要调控因子,为阐明蛋白4.1R对肥大细胞信号转导调控的分子机制奠定基础,对理解和丰富有关肥大细胞活化与调控的理论具有重要意义。研究方法1.取4.1R~(+/+)和4.1R-/-C57BL/6J小鼠股骨和胫骨中的骨髓,用RPMI1640培养基重悬。体外培养四周后收集悬浮细胞,得到BMMC。甲苯胺蓝染色,光镜下比较4.1R~(+/+)和4.1R-/-BMMC生长形态;用FITC标记的anti-mouse FcεRIα抗体和PE标记的anti-mouse CD117共染,流式细胞仪检测分析肥大细胞纯度。2.培养成熟的4.1R~(+/+)和4.1R-/-BMMC,提取总RNA后反转录成cDNA,PCR反应及琼脂糖电泳进行基因型鉴定,测序鉴定肥大细胞中蛋白4.1R剪切体外显子组成。3.利用吸光光度法研究4.1R基因缺失对IgE介导的BMMC脱颗粒的影响。4.利用qRT-PCR方法研究4.1R基因缺失对于BMMC炎症因子IL-6、IL-4、IL-13和TNF-α在不同活化时间点转录水平的影响。5.利用qRT-PCR方法研究4.1R基因缺失对BMMC FcεRI在不同活化时间点转录水平的影响,利用流式细胞仪检测分析4.1R基因缺失对BMMC表面FcεRIα表达的影响。6.建立4.1R~(+/+)和4.1R-/-C57BL/6J小鼠被动皮肤过敏反应模型,吸光光度法比较两种基因型小鼠耳部血管渗透性,将耳朵包埋切片,病理学观察比较两种基因型小鼠组胺释放导致的耳部肿胀程度。7.建立4.1R~(+/+)和4.1R-/-C57BL/6J小鼠迟发相皮肤过敏反应模型,比较两种基因型小鼠耳厚耳重,将耳部包埋切片,病理学观察比较小鼠耳部肥大细胞介导的炎性细胞浸润程度,将切片进行甲苯胺蓝染色,显微镜下统计耳部肥大细胞脱颗粒率。并利用qRT-PCR方法比较两种基因型小鼠耳部炎症因子IL-6转录水平。研究结果1.培养成熟的4.1R~(+/+)和4.1R-/-BMMC经过流式细胞仪检测分析纯度达到85%以上,可用于后续实验,光镜下观察静息状态的两种基因型BMMC生物学形态无差别。2.RT-PCR结果显示,4.1R-/-C57BL/6J小鼠的BMMC中缺失4.1R 135kDa和80kDa。绘制BMMC中4.1R基因外显子图谱,与小鼠源4.1R完整外显子序列比对分析,4.1R~(+/+)BMMC中蛋白4.1R 135kDa表达缺失外显子3、14、15、16,蛋白4.1R 80kDa表达缺失外显子14、15、16。3.吸光光度法结果显示活化后4.1R-/-BMMC脱颗粒程度显著高于4.1R~(+/+)BMMC。4.qRT-PCR结果显示:4.1R-/-BMMC中的IL-6和IL-4、IL-13在刺激10min时转录水平显著高于4.1R~(+/+)BMMC。5.qRT-PCR结果显示:4.1R基因缺失后,在刺激10min、1hr时,FcεRIα、β、γ的mRNA表达水平显著增加;但是两种基因型BMMC膜表面FcεRIα表达并没有差异。6.被动皮肤过敏反应实验结果显示:4.1R-/-C57BL/6J小鼠耳部渗透出的伊文思蓝染料量显著高于4.1R~(+/+)小鼠,说明4.1R基因缺失后,C57BL/6J小鼠耳部组胺导致的血管渗透性增强,病理切片结果显示,4.1R-/-C57BL/6J小鼠耳部组胺导致的肿胀程度也显著高于4.1R~(+/+)小鼠。7.迟发相皮肤过敏反应实验结果显示:4.1R-/-C57BL/6J小鼠耳厚耳重显著高于4.1R~(+/+)小鼠,4.1R基因缺失后,C57BL/6J小鼠耳部肥大细胞介导的炎性细胞浸润程度显著增强,以及IL-6转录水平也显著增高,但是耳部肥大细胞的脱颗粒率没有显著性差异。研究结论4.1R能够抑制IgE介导的肥大细胞脱颗粒和细胞因子的分泌,并且对过敏反应性疾病发挥负调控作用。
[Abstract]:The activation of mast cells in mast cells plays an important role in the activation of mast cells . 4 . 1R ~ ( ++ ) and 4.1R ~ ( + ) and 4.1R - / - BMMC were used to study the effect of 4.1R gene deletion on IgE - mediated activation and proliferation of mast cells .

【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R392

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