抑制糖原合成酶激酶3β诱导巨噬细胞表型转化及其对组织损伤的保护作用

发布时间：2018-01-15 13:07

  本文关键词：抑制糖原合成酶激酶3β诱导巨噬细胞表型转化及其对组织损伤的保护作用　出处：《南京大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：研究目的： 了解抑制GSK3β对体外诱导分化M1型Mψψ表型的影响及机制并探讨GSK3β抑制剂(TDZD-8)对叶酸肾损伤模型小鼠肾脏Mψψ表型的影响和肾脏损伤的保护作用。研究方法：体外培养骨髓细胞,在脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)和Y-干扰素(intertferon-gamma, IFNy)作用下转化为M1型Mψψ。分别使用不同浓度糖原合成酶激酶3β (glycogen synthase kinase 3β, GSK3β)抑制剂TDZD-8(0,1,2.5,5μM)和氯化锂(Lithium Choloride, LiCl)、SiRNA干扰技术抑制GSK3β,通过免疫荧光、蛋白印迹以及流式细胞等方法检测Mψψ表面标志物如M1标志物诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)和白介素-1β (interleukin-1 beta,IL-1p)和M2标志物精氨酸酶I (arginase I, Arg I)和甘露糖受体(mannose receptor, MR)表达的变化情况,以及该过程中细胞信号传导及转录激活因子(signal transducers and activators of transcription, STAT)以及过氧化物酶体增殖物激活受体γ (peroxisome proliferator-activated receptor, PPAR-γ)活性的变化。并通过使用相应STAT、PPARγ的激活剂／抑制剂探讨GSK3β抑制剂诱导Mψψ表型变化的潜在机制。在急性肾损伤叶酸动物模型中应用GSK3β抑制剂TDZD-8,采用前处理(TDZD-pre,叶酸注射前30分钟单次给药)和后处理(TDZD-post,在叶酸注射后第5天单次给药),观察各组小鼠肾功能指标变化情况,并在第7天观察肾脏损伤以及组织内Mψψ的表型,以及在第28天时肾脏组织纤维化的程度。研究结果： 体外研究发现,骨髓细胞培养诱导分化的Ml型Mψψ在不同浓度TDZD-8作用48小时后,细胞表达iNOS和IL-1β显著下降,而ArgI和MR受体表达显著上升,这种作用在TDZD-80-5μM浓度区间呈剂量依赖。免疫荧光检测显示在TDZD-8作用下,M1型Mψψ表达iNOS显著下降,流式细胞仪检测表明TDZD-8使M1型Mψψ表达MR显著上升。使用SiRNA干扰技术发敲低GSK3β表达后M1型Mφ表达ArgⅠ和MR显著上升。M1型Mφ在5μM TDZD-8干预下,细胞pSTAT1, pSTAT6的表达在120分钟内无显著变化,pSTAT3的表达呈时间依赖下降。 使用STAT3特异性抑制剂(stattic)对M1型Mφ进行干预,M1型Mφ表达M2标志物(ArgⅠ和MR)无显著上调。M1型Mφ在TDZD-8干预下,细胞抑制性磷酸化PPARy (pPPARy)表达显著下调。使用PPARy抑制剂(GW6229)和TDZD-8对M1型Mφ共处理后,TDZD-8诱导的M2标志物(ArgⅠ和MR)表达的上调能被显著抑制。体内对叶酸肾损伤模型的研究发现,在损伤早期,小鼠肾脏小管间质呈现典型的急性肾损伤的特点,血清肌酐(serum creatinine, Scr)显著上升。急性期过后,尽管Scr逐渐下降,但肾脏组织逐渐出现慢性化病变,在28天后肾脏组织有明显的胶原Ⅰ和纤维连接蛋白沉积。在损伤前预防性给予(前处理)或在损伤后第5天给予(后处理)TDZD-8均可显著减轻第7天时肾脏的损伤,并减轻第28天时肾脏的纤维化。前处理后肾脏组织中细胞凋亡(TUNEL)显著减少,细胞增生、修复(Ki-67, PAX 2)等指标表达显著上升,组织中M2型Mφ比例无显著上调(TDZD-pre:FA:26.8±12.4 vs 17.4±5.7, P0.05)。后处理中,组织也表现为细胞凋亡(TUNEL)的减少,细胞增生、修复(Ki-67, PAX 2)等指标表达的上调,但程度显著弱于前处理组(P0.05)。后处理中组织中M2型Mφ比例显著高于前处理组(TDZD-pre:TDZD-post:26.8±12.4 vs 85.7±9.3, P0.01)。研究结论：抑制GSK3β可诱导M1型Mφ向M2转化。后处理中使用GSK3β抑制剂TDZD-8具有诱导叶酸肾脏损伤模型肾脏组中Mφ向M2转化的作用,并减轻肾脏的纤维化,这一作用至少部分依赖于PPAR-γ通路实现。以上结果提示,GSK3β可作为潜在急性肾损伤的干预靶点改善肾脏的远期预后。
[Abstract]:Objective: To investigate the effect of inhibition of GSK3 beta on in vitro differentiation of M1 type M psi psi phenotype, and to explore the mechanism of GSK3 beta inhibitor (TDZD-8) protective effect of folic acid effect on renal injury model of mouse kidney M psi psi phenotype and kidney injury. Methods: bone marrow cells were cultured in vitro and in lipopolysaccharide (Lipopolysaccharide, LPS) interferon and Y- (intertferon-gamma, IFNy) under the action of transformation to M1 M psi. Psi respectively with different concentrations of glycogen synthase kinase 3 beta (glycogen synthase kinase GSK3 3 beta, beta) inhibitor TDZD-8 (0,1,2.5,5 M) and lithium chloride (Lithium Choloride, LiCl), the inhibition of GSK3 beta SiRNA interference by immunofluorescence, Western blot and flow cytometry assay M psi psi surface markers such as M1 markers of inducible nitric oxide synthase (iNOS inducible nitric oxide synthase) and interleukin -1 beta (interleukin-1 beta, IL-1p and M2) Markers of arginase I (arginase I, Arg I) and mannose receptor (mannose receptor, MR) expression changes, and the process of cell signal transducer and activator of transcription (signal transducers and activators of transcription, STAT) and the peroxidase proliferator activated receptor gamma (peroxisome proliferator-activated receptor PPAR-, gamma) activity changes. And by using the corresponding STAT, PPAR gamma activator / inhibitor of GSK3 inhibitor M beta psi psi phenotypic changes induced by damage mechanism. Potential application of GSK3 beta inhibitor TDZD-8 in animal models of folic acid in acute kidney, before treatment using folic acid (TDZD-pre, 30 minutes before the injection of single dose (TDZD-post) and postprocessing, Fifth days after the injection of folic acid in single dose), observe the change of renal function in mice groups, and observe the renal injury and tissue M psi psi phenotype in seventh days, And the degree of renal fibrosis in twenty-eighth days. Results: in vitro, bone marrow cell culture and induced differentiation of Ml type M psi psi in 48 hours with different concentrations of TDZD-8, iNOS and IL-1 beta cell expression decreased significantly, while ArgI and MR receptor expression increased significantly, this effect was dose dependent in TDZD-80-5 M concentration range. Immunofluorescence staining results showed that in the presence of TDZD-8, M1 type M psi psi significantly decreased the expression of iNOS, flow cytometry showed that TDZD-8 type M1 M psi psi significantly increased expression of MR. Using SiRNA interference technology after knockdown of GSK3 expression of M1 type M with expression of Arg 1 and MR increased significantly.M1 M in 5 M TDZD-8 intervention, pSTAT1 cells, pSTAT6 expression did not change significantly in 120 minutes, the expression of pSTAT3 in a time dependent decrease. The use of STAT3 specific inhibitor (stattic) intervention on type M1 M type M1 M Phi Phi, the expression of M2 markers (Arg I and MR) no significant upregulation of.M1 M in TDZD-8 intervention, cell inhibitory phosphorylation of PPARy (pPPARy) expression was significantly reduced. The use of PPARy inhibitors (GW6229) and TDZD-8 of M1 M were treated with M2 markers, induced by TDZD-8 (Arg 1 and MR) can be significantly up-regulated study on folic acid suppression. Kidney injury model in vivo, in early injury, renal tubular interstitial characteristics of mice showed typical acute kidney injury, serum creatinine (serum creatinine, Scr) increased significantly. After the acute phase, while Scr decreased gradually, but the kidney tissue gradually appeared chronic lesions, obvious collagen and after 28 days of kidney tissue fibronectin deposition. Prophylactic administration in before injury (pretreatment) or in the fifth day after injury to kidney injury (postprocessing) of TDZD-8 can be significantly reduced by seventh days, and reduce renal fibrosis twenty-eighth days before treatment. Cell apoptosis in kidney tissue (TUNEL) significantly reduced cell proliferation and repair (Ki-67, PAX 2) index increased significantly, the M2 organization in M. There was no significant increase (TDZD-pre:FA:26.8 + 12.4 vs 17.4 + 5.7, P0.05). Postprocessing, tissue also showed cell apoptosis (TUNEL). Reduced cell proliferation and repair (Ki-67, PAX 2) were up-regulated, but significantly weaker than the pretreatment group (P0.05). M2 in postprocessing tissue M Phi ratio was significantly higher than before treatment group (TDZD-pre:TDZD-post:26.8 + 12.4 vs 85.7 + 9.3, P0.01). Conclusion: GSK3 can inhibit beta conversion to M2 induced M1 M phi. Postprocessing using the GSK3 beta inhibitor TDZD-8 can induce transformation of M to M2 with folic acid model of renal injury in the group of kidney function and relieve renal fibrosis, this effect is at least partly dependent on PPAR- gamma pathway. These results suggest that GSK3 can be used as a potential beta The intervention target of acute renal injury improves the long-term prognosis of kidney.

【学位授予单位】：南京大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R392

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