抑制PGC-1α的表达对PD模型小鼠炎症反应的影响

发布时间：2018-01-16 01:18

  本文关键词：抑制PGC-1α的表达对PD模型小鼠炎症反应的影响　出处：《河北师范大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

  更多相关文章： 帕金森病 PGC-1α 慢病毒 多巴胺能神经元 胶质细胞 炎症反应 MPTP C57BL/6小鼠

【摘要】：帕金森病(PD)是继阿尔茨海默病之后的第二种最常见的神经系统退行性疾病,也是中老年中发病率较高的神经系统变性疾病。PD的主要特征表现为运动迟缓、僵硬、震颤和姿势不稳定性。虽然这些症状已经是PD的经典描述,但最近其被公认为是一个更加复杂的疾病,包括运动症状和非运动症状(NMS),如抑郁症、睡眠障碍、感觉异常、植物神经功能紊乱和认知能力的下降。研究发现,与PD发生密切的因素主要有线粒体功能障碍、氧化应激、α-突触核蛋白基因突变等遗传因素、环境因素、炎症反应等,但具体发病机制尚不完全清楚。在上述众多因素中,线粒体功能障碍和氧化应激反应是引发PD的主要因素。线粒体是生命个体中直接提供能量的细胞器,其在维持神经元正常功能上起到非常重要的作用。线粒体复合物Ⅰ(mitochondrial complexⅠ)是线粒体呼吸链中最大的复合体,是线粒体发挥氧化磷酸化功能的关键。其异常可以引起活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)生成增多,从而引发细胞损伤,乃至死亡。除此之外,胶质细胞诱发的炎症反应对PD的影响逐渐成为研究的热点。在正常情况下,胶质细胞处于静息状态。当神经元损伤导致免疫原性分子释放时,胶质细胞呈现变形形态,并显示出相应的活化表型。神经炎症最显著的特点是小胶质细胞和星形胶质细胞的激活与增生。胶质细胞的激活可以产生大量有害的活性氧(ROS)和活性氮(RNS),与此同时,还可以分泌大量促炎细胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-6和干扰素γ(IFN-γ),结合神经元受体从而启动细胞的死亡途径。近年来,有多种生理功能活性的过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)的共激活因子1α(PGC-1α)受到越来越多的关注。其功能除了对线粒体的生物发生及代谢过程起到非常重要的作用外,还发现PGC-1α有抑制炎症反应的作用,其机制可能是通过调节NF-κB信号通路来抑制胶质细胞的激活与增生而抑制炎症反应的过程,从而对神经元起到保护作用。但在PD发生过程中,PGC-1α起到何种作用?其表达的变化与炎症反应和PD发生之间是何种关系?这是一个值得深入探讨的问题。本研究拟通过降低PGC-1α的表达,观察其表达情况与炎症反应之间关系、是否对神经元起到保护作用、以及是否可以改善PD小鼠的症状等对上述问题进行探讨。本研究以C57BL/6小鼠为对象,用立体定位注射方法将构建的抑制PGC-1α表达的慢病毒载体注射至小鼠的一侧黑质,饲养28 d后,再通过腹腔注射MPTP的方法复制PD小鼠亚急性模型。实验分为空白对照组(立体定位saline,腹腔注射saline,记为saline+saline组)、实验对照组(立体定位saline,腹腔注射MPTP 30 mg/kg,记为MPTP+saline组)、实验空载组(立体定位空载慢病毒载体NCKD,腹腔注射MPTP,记为MPTP+NCKD组)、实验组(立体定位抑制PGC-1α表达的慢病毒载体,腹腔注射MPTP,记为MPTP+KD组)。采用行为学方法检测帕金森症状;免疫荧光染色方法检测黑质内TH、PGC-1α等阳性细胞,以及小胶质细胞的标记物Iba1(ionized calcium-binding adapter molecule 1,Iba1)的数量和星形胶质细胞标记物GFAP(Glial Fiber Acid Protein,GFAP)的累积光密度;FJC染色法检测凋亡细胞的数量;Western blot技术检测TH、PGC-1α蛋白在黑质内的表达情况,以探究抑制PGC-1α的表达对PD小鼠行为症状,以及炎症反应相关的小胶质细胞和星形胶质细胞的增殖情况的影响,揭示PGC-1α、炎症和PD之间的关系。所得实验结果如下:1.用腹腔注射MPTP(30 mg/kg)的方法成功复制出PD小鼠模型。并随着MPTP注射天数的增加,存活的多巴胺能神经元、PGC-1α阳性细胞逐渐减少,凋亡细胞数逐渐增加;TH、PGC-1α蛋白表达量越来越少;炎症反应越来越重,最终确定MPTP最佳损伤时间窗为3 d。2.成功构建了抑制PGC-1α表达的慢病毒载体,用q PCR方法检测出最佳干扰靶点,通过荧光法测定出病毒的最佳滴度为5×108 TU/ml。3.MPTP+KD组黑质DA能神经元数量较MPTP+saline组显著减少(P0.05);MPTP+KD组小鼠自主活动及站立次数较MPTP+saline组呈下降趋势,而转棒掉落次数以及游泳停顿时间较MPTP+saline组呈递增趋势,但均无统计学差异。4.MPTP+KD组黑质PGC-1α阳性细胞数较MPTP+saline组显著减少(P0.05),这表明立体定位注射抑制PGC-1α表达的慢病毒载体起到了减少PGC-1α表达的作用。5.定位注射抑制PGC-1α表达的慢病毒载体后,MPTP+KD组黑质内小胶质细胞以及星形胶质细胞的表达量较MPTP+saline组显著降低(P0.05)。提示炎症反应降低。通过上述结果的分析,得出如下结论:1.通过炎症与DA神经元的存活与凋亡确定了MPTP最佳损伤时间窗为3 d。2.筛选出抑制PGC-1α表达的慢病毒载体,病毒滴度为5×108 TU/ml。3.抑制PGC-1α的表达,显著减少黑质DA能神经元存活数量、增多其凋亡,同时也降低小胶质细胞以及星形胶质细胞的激活程度。上述结果表明,抑制PGC-1α的表达,可通过影响小胶质细胞和星形胶质细胞的活性而降低炎症反应。本研究为防治帕金森氏病提供了基础资料,但相关的机制还有待于后继的进一步研究。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：河北师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R742.5;R-332

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本文编号：1430916