家蚕蛹表达的重组Aβ42,CTB-Aβ42和CTB-Aβ15蛋白对阿尔茨海默症模型鼠的口服免疫和保护作用研究

发布时间：2018-02-23 17:13

  本文关键词： 阿尔茨海默病 淀粉样蛋白 蚕蛹 家蚕生物反应器 老年斑　出处：《浙江大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：众多研究表明,β淀粉样蛋白(Ap)的沉积导致脑内老年斑和淀粉样血管病的形成是阿尔茨海默症(AD)发病机制中的关键环节。老年斑主要由β淀粉样蛋白Aβ40和Aβ42的聚集而形成,Aβ42是其中最重要的毒性成分。Aβ的主动免疫对不同的AD转基因鼠动物模型均有治疗作用,而Aβ肽注射疫苗在临床试验中表现了积极的治疗作用但出现了一定比例的副作用。寻找既能高效抑制老年斑的形成,又能消除临床上不良反应的疫苗成了研究的焦点。本研究为了使疫苗具有更温和的抗原-抗体反应,采取了Aβ蛋白在家蚕生物反应器表达并制成口服粉剂的方式；为了增强Aβ基因的表达并降低TH1型免疫反应的不良影响,使Aβ肽与霍乱毒素B亚基(CTB)融合表达；此外保留Aβ肽B细胞表位同时减少T细胞表位也可以降低TH1型免疫反应的副作用,因此选择决定B细胞表面抗原的Ap15肽作为抗原有可能避免Aβ42全肽免疫的不良反应。蚕蛹富含人体所需的各种氨基酸及不饱和脂肪酸,且蚕蛹蛋白本身具有许多生理和药理活性,可以用作医药中间体。另外,将蚕蛹作为接种载体,具有操作简便、回收便捷、表达量高等优点。本研究尝试用家蚕生物反应器,并运用与能够增强黏膜免疫效果的CTB融合表达的方式分别生产Aβ42, CTB-AP42和CTB-Aβ15蛋白,并分别用表达Aβ42, CTB-Aβ42和CTB-Aβ15蛋白的工程蚕蛹制备蚕蛹冻干粉以更安全的口服的形式免疫阿尔茨海默症模型小鼠。采用水迷宫、免疫组化、ELISA、图像分析技术等手段,从行为、细胞、分子水平来评价蚕蛹表达的Aβ42, CTB-Aβ42和CTB-Aβ15蛋白对阿尔茨海默症的防治效果。本研究通过基因重组技术将Aβ42, CTB-Aβ42和CTB-Aβ15基因克隆入家蚕杆状病毒表达系统转移载体质粒pBacPAK8中,并将重组质粒pBacPAK8-Aβ42, pBacPAK8-CTB-Aβ42和pBacPAK8-CTB-Aβ15与线性化的家蚕杆状病毒Bm-BacPAK6的DNA在家蚕BmN细胞中共转染,获得重组家蚕杆状病毒BmNPV-Aβ42, BmNPV-CTB-Aβ42和BmNPV-CTB-Aβ15。用重组家蚕杆状病毒BmNPV-Aβ42, BmNPV-CTB-Aβ42和BmNPV-CTB-Aβ15感染家蚕BmN细胞和蚕蛹,得到成功表达；并用BmNPV-Aβ42和BmNPV-CTB-Aβ15感染家蚕五龄幼虫,获得成功表达。其中,Aβ42蛋白在BmN细胞内的表达水平最高可达2.2μg/2×106细胞,五龄幼虫血淋巴中可达2 μg/mL,蚕蛹中表达量可达0.3 μg/g；CTB-Aβ42融合蛋白在细胞中的表达量可达10 μg/2×106细胞,蚕蛹中表达量可达0.5μg/g; CTB-Aβ15融合蛋白在细胞中的最大表达量可达5μg/2×106细胞,五龄幼虫血淋巴中可达0.8μg/mL,而在蚕蛹中的表达量能够达到10μg/g。蚕蛹表达的Aβ42, CTB-Aβ42和CTB-Aβ15重组蛋白作为口服AD剂型均可诱导AD模型B6C3-Tg小鼠产生抗Ap抗体,与生理盐水对照组比较有显著性差异,其中CTB-Aβ42和CTB-Aβ15免疫组诱导产生Ap抗体的滴度较Aβ42组局(CTB-Aβ42组：1：420,CTB-Aβ15组：1：390,Aβ42组：1：300,对照组：1：100)。用来评价小鼠的记忆和认知能力的水迷宫测试定位航行实验中,服用了表达Aβ42, CTB-Aβ42和CTB-Aβ15重组蛋白的蚕蛹源口服AD剂型组的小鼠,在第四,第五天的训练中,表现优异,潜伏期缩短,其中CTB-Aβ42免疫组和CTB-Aβ15免疫组与服用生理盐水的对照组形成显著性差异。第六天撤掉平台的空间搜索实验中,三个口服AD剂型组与对照组相比在曾放置平台的目标象限停留的时间都更长,穿越平台区的平均次数更多(CTB-Aβ42组：2.2,CTB-Aβ15组：1.8,Aβ42组：1.8,对照组：0.6),CTB-Aβ42免疫组与生理盐水对照组差异显著。对脑内老年斑的免疫组化分析显示,三个口服AD剂型免疫组的小鼠与对照组相比,在脑的前叶,海马和皮质部分都有不同程度的老年斑的减少。实验结果显示,对照组和Aβ42剂型免疫组的小鼠脑内的老年斑斑块较大,而服用表达CTB-Aβ42和CTB-Aβ15融合蛋白的蚕蛹免疫组的小鼠脑内的老年斑斑块相对小而分散,在脑内所占的相对面积较小。B6C3-Tg小鼠脑内可溶和不可溶的Aβ42肽的含量测定发现服用表达CTB-Aβ42和CTB-Aβ融合蛋白的蚕蛹免疫组的小鼠脑内无论是可溶和不可溶的Aβ42肽都显著低于对照组小鼠。综合评价提示,蚕蛹表达的Aβ42, CTB-Aβ42和CTB-Aβ15重组蛋白作为口服制剂在AD模型小鼠上具有明显改善AD小鼠的阿尔茨海默病病症,有望开发为AD口服疫苗。
[Abstract]:In order to improve the expression of A尾42 , CTB - AP42 and CTB - A尾15 protein and to reduce the adverse effects of TH1 - type immune response , it is suggested that the expression of A尾42 , CTB - A尾42 and CTB - A尾15 protein can be used as an intermediate . The results showed that the expression of CTB - A尾42 , CTB - A尾42 and CTB - A尾15 recombinant protein could induce the AD model of AD model . The titers of CTB - A尾42 and CTB - A尾15 immune groups were higher than those in normal saline control group ( CTB - A尾42 group : 1 : 390 , A尾42 group : 1 : 300 , control group : 1 : 100 ) . The results showed that both soluble and insoluble A尾42 and CTB - A尾42 and CTB - A尾15 were significantly lower in the brain than in the control group . The results showed that both soluble and insoluble A尾42 and CTB - A尾42 were significantly lower in the brain .

【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R749.16;R-332

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本文编号：1526927