IFITM3诱导表达细胞系的建立及抗流感病毒研究

发布时间：2018-07-31 10:58

【摘要】：IFITMs是由干扰素刺激基因编码的Ⅱ型跨膜蛋白,为膜相关宿主限制因子。该家族成员中的IFITM1、IFITM2和IFITM3为免疫相关IFITM,在多种组织和细胞中广泛表达,参与体内多种生理活动。自1996年以来,IFITMs抗病毒活性及机制已成为研究热点。大量研究表明,IFITMS够抑制多种囊膜病毒的感染,包括甲型流感病毒、人类免疫缺陷病毒以及新出现的寨卡病毒等。IFITM3作为其家族成员之一,对抑制甲型流感病毒感染发挥至关重要的作用。据报道,IFITM3可通过干扰网格蛋白介导的病毒-宿主细胞膜融合过程抑制流感病毒进入,但具体机制尚不清楚。因此,本研究基于Tet-On 3G系统,构建了含有人IFITM3基因的真核表达质粒pLVX-TRE3G-IFITM3;并与调控质粒pLVX-Tet3G共转染MDCK细胞,转染后48 h用G418和嘌呤霉素进行加压筛选,Dox对获得的细胞系进行诱导表达鉴定,并进行Dox敏感性分析、IFITM3+细胞百分数及定位分析。结果显示,成功筛选出可诱导表达人IFITM3的MDCK细胞系,且IFITM3表达量与诱导时间和Dox使用浓度相关;确定Dox工作浓度为2.5μg/mL,诱导12 h时IFITM3+细胞数达75%以上,且IFITM3在晚期内体/溶酶体存在分布;其次,将扩增出的流感病毒HA5、HA7和NA9基因分别连接到真核表达载体pcDNA 3.1上,转染293细胞鉴定IFITM3的表达。然后利用本课题组优化建立的第三代慢病毒包装质粒系统,制备了以携带萤光素酶报告基因的HA5和HA7为外膜的假型病毒颗粒(H5N9pv-Luc,H7N9pv-Luc),通过萤光素酶活性及感染实验检测其感染性。结果显示,HA5、HA7和NA9转染后在细胞内可有效表达且包装获得的假型病毒具有感染活性。基于以上研究基础,以H5N9pv-Luc或H7N9pv-Luc及H5N1禽流感病毒为感染模型,分别利用siRNA干扰、萤光素酶分析、自行建立的禽流感病毒实时荧光定量PCR检测方法、荧光分子标记病毒及流式细胞术等方法进行病毒感染、进入及融合实验研究,从正反两方面证实IFITM3抑制流感病毒HA介导的病毒进入及膜融合,抑制病毒的复制及感染。综上所述,IFITM3对流感病毒HA5和HA7介导的病毒进入具有抑制活性,为继续探索其中的具体作用机制奠定了坚实的基础。
[Abstract]:IFITMs is a type 鈪，

本文编号：2155372