Stra8在精子发生中作用机制的初步研究

发布时间：2018-09-05 19:59

【摘要】：Stra8基因是一个生殖腺特异性表达基因,其表达受到视黄酸(Retinoic acid,RA)的调控。Stra8基因敲除后雄性小鼠失去生育能力,精子发生阻滞在减数分裂阶段,此过程中Stra8的作用机制尚未阐明。为了进一步探究Stra8在精子发生中的分子机制,本论文从以下三个部分展开了实验研究。第一部分:精子发生中Stra8下游作用基因及调控网络的初步研究目的:探索Stra8在精子发生中的作用机制,找寻其可能的下游作用基因,研究其下游调控网络。方法:将Stra8.KO杂合型(Stra8+/-)小鼠合笼,收集子代纯合型(Stra8-/-)和野生型(Stra8+/+)小鼠。取出生后5天～12天小鼠,制不同日龄睾丸组织切片,HE染色,观察睾丸组织结构。用生精细胞标志物Ddx4对不同日龄小鼠睾丸组织行免疫组织化学荧光染色,并对阳性生精细胞进行计数及统计学分析。选取出生后11天Stra8-/-和Stra8+/+小鼠睾丸组织进行RNA-Sequnce,应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)对RNA-Sequnce中表达有差异的基因进行验证。结果:出生后不同日龄小鼠,5～11天Stra8-/-和Stra8+/+小鼠睾丸组织结构相似,单个生精小管内生精细胞数量无明显统计学差异。第12天时,Stra8+/+小鼠生精小管管腔内初级精母细胞与Stra8-/-小鼠相比明显增多,且单个生精小管内生精细胞数量有显著性差异。RNA-Sequnce分析发现了 96个RNA在Stra8敲除后表达量有显著性差异,其中40个RNA表达下调,56个RNA表达上调。对其中21个基因进行qRT-PCR验证,结果发现这些RNA的表达水平与RNA-Sequnce结果相一致。结论:应用RNA-Sequnce等实验,发现了 96个Stra8基因敲除后差异表达的RNA,其中21个基因可能参与精母细胞减数分裂、精原细胞自我更新及精原细胞分化等过程的调控。Stra8可能通过调控上述差异表达基因,调节精子发生过程。第二部分:兔抗小鼠Setd8多克隆抗体的制备目的:获得小鼠Setd8原核蛋白,制备兔抗小鼠Setd8多克隆抗体。方法:将pGADT7-Setd8质粒和pET-30a载体分别双限制性内切酶酶切后连接、转化和鉴定,构建pET-30a-Setd8原核表达质粒。将pET-30a-Setd8质粒转化到E.coli BL21中,用IPTG诱导蛋白表达,通过镍亲和层析柱蛋白纯化。用纯化的Setd8蛋白免疫新西兰大白兔,获得Setd8多克隆抗体。应用ELISA、Western blot及免疫组织化学法对Setd8多克隆抗体进行效价测定及特异性鉴定。结果:限制性内切酶双酶切法及序列测定法表明:pET-30a-Setd8重组质粒构建成功。IPTG诱导后,大肠杆菌可高效表达Setd8原核蛋白。获得的Setd8多克隆抗体经ELISA检测,效价为1:1 000 000。Western blot结果显示:Setd8多克隆抗体能特异性识别细胞中的Setd8蛋白。免疫组织化学法显示:Setd8主要表达在成年小鼠睾丸组织中的精原细胞。结论:成功获得较高纯度Setd8蛋白,制备的Setd8多克隆抗体具有较高反应性和特异性。第三部分:成年小鼠睾丸内精原细胞及精母细胞的纯化目的:建立一个简便、高效的成年小鼠睾丸精原细胞、精母细胞纯化方法。方法:运用酶消化法将成年小鼠睾丸制备成单细胞悬液,经9层非连续Percoll密度梯度(17%、22%、25%、28%、31%、34%、37%、40%和90%)离心法分离,通过组织学染色和计数法确定精原细胞及精母细胞的纯度。结果:酶消化后所得睾丸单细胞悬液经Percoll密度梯度离心,共形成9条细胞带,其中22%密度梯度中主要为精子细胞;而31%、34%及37%密度梯度中主要为精原细胞及精母细胞,且纯度较高,达71.50%。结论:联合运用酶消化法和非连续Percoll密度梯度离心法,可从成年小鼠睾丸中分离出较高纯度的精原细胞及精母细胞。
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【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R321.1

【参考文献】