Dysbindin-1在小鼠睾丸组织中相互作用蛋白的筛选及鉴定

发布时间：2021-03-18 14:05

目的:通过筛选并鉴定(肌)营养不良短小蛋白结合蛋白1(dystrobrevin binding protein1,dysbindin-1)在睾丸组织中的相互作用蛋白,研究dysbindin-1在睾丸中的可能功能。方法:在Rosetta(DE3)菌种中诱导表达可溶性GST-dysbindin-1融合蛋白,经谷胱甘肽-琼脂糖珠亲和纯化后,与小鼠的睾丸组织蛋白孵育进行GST pull-down实验,通过液相色谱串联质谱(LC MS/MS)分析筛选dysbindin-1在睾丸组织中的相互作用蛋白。利用BioGPS数据库聚类睾丸组织中高表达和特异性表达的互作蛋白,运用DAVID6.8在线分析工具从细胞组分、分子功能、生物学过程和京都基因与基因组百科全书通路等方面对筛选出的互作蛋白进行GO(gene ontology)富集分析。选择我们感兴趣的潜在互作蛋白囊泡分选蛋白4A(vacuolar protein sorting 4A,vps4a),通过分子克隆技术构建原核和真核表达载体,运用GST pull-down、免疫共沉淀等实验,验证dysbindin-1与vps4a的互作关系。结果:1.本实验共筛选出108个dysbindin-1在睾丸组织中的潜在互作蛋白,其中98个为尚未报道的dysbindin-1互作蛋白,7个为睾丸高表达蛋白,5个为睾丸特异性表达蛋白。2.DAVID 6.8在线分析工具GO富集分析发现:这些候选蛋白主要分布在细胞质、细胞核、细胞膜、细胞外泌体等细胞组分中,通过与蛋白质、核酸等分子结合参与蛋白翻译和转运、囊泡运输及凋亡等生物学过程以及氨基酸生物合成、溶酶体及蛋白酶体等生物学通路。3.通过GST pull-down和免疫共沉淀实验证实dysbindin-1和vps4a存在相互作用。结论:Dysbindin-1在小鼠睾丸组织中与多种蛋白相互作用,可能参与精子发生和受精等生物学过程。
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R363

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前言

第一部分 GST pull-down联合质谱筛选dysbindin-1 互作蛋白

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

2 结果

2.1 GST及GST-dysbindin-1 原核诱导表达及纯化

2.2 体外GST pull-down结合实验筛选dysbindin-1 相互作用蛋白

第二部分 Dysbindin-1 潜在互作蛋白的功能分析

1 材料与方法

1.1 实验材料和方法

2 结果

2.1 新发现的dysbindin-1 相互作用蛋白

2.2 Dysbindin-1 潜在互作蛋白GO功能注释富集分析

第三部分体外实验验证dysbindin-1 与vps4a的相互作用

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

2 结果

2.1 PCR扩增vps4a基因

2.2 构建及鉴定重组质粒pCMV-Tag 2B/vps4a

2.3 亚克隆重组质粒pGEX-4T-1/vps4a的构建及鉴定

2.4 体外GST pull-down实验

2.5 免疫共沉淀实验

讨论

结论

参考文献

综述

参考文献

附录

致谢

个人简历

【参考文献】