具有中和功能的抗单体C-反应蛋白单克隆抗体的制备及其初步应用
发布时间：2019-09-25 00:18
【摘要】：目的:制备单体C-反应蛋白(monomeric C-reactive protein,mCRP)的单克隆抗体。方法:用合成的人C-反应蛋白末端八肽氨基酸,与牛血清白蛋白偶联后免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按5∶1的比例融合,间接竞争ELISA法和有限稀释法进行单克隆杂交瘤细胞的筛选;制备腹水抗体;采用Protein G亲和层析法纯化抗体,用间接ELISA和Western blot方法测定抗体特异性,并采用该单抗研究其对mCRP干预的乳大鼠心肌细胞的保护作用。结果:得到1株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,纯化后的单克隆抗体纯度达98%,抗体活性良好,并且该抗体可以降低mCRP导致的心肌细胞TGF-β的表达。结论:成功获得1株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞,并对其初步应用进行了鉴定,并证实其可以中和mCRP引起的心肌细胞的损伤作用。
【图文】：
ne-wayANOVA）比较各组间均数差异，P≤0．05为差异有统计学意义。2结果2．1杂交瘤细胞株的建立细胞融合后经HAT培养液筛选以及间接ELISA检测，取上清效价最高的细胞株采用有限稀释法单克隆化3次。杂交瘤细胞株经培养14周后仍能稳定分泌单克隆抗体，且经液氮冻存、复苏后，此细胞株仍能稳定分泌特异性抗mCRP抗体。2．2单抗的纯化小鼠腹腔接种分泌mCRP单抗的杂交瘤细胞后共获得15ml腹水，采用ProteinG亲和层析法提取纯度较纯、活性较好的mCRP抗体，进行SDS-PAGE（图1）。2．3单抗的鉴定抗体的效价测定结果见图2，表明所制备的mCRP抗体与mCRP蛋白有较好的亲和力。Westernblot结果显示所纯化的mCRP抗体能与mCRP蛋白特异性结合，在23000处出现目的条带，与mCRP蛋白的预期大小相符（图3）。2．52．01．51．00．50D（450nm）1∶10001∶25001∶100001∶50001∶200001∶40000稀释倍数纯化的mCRP抗体SP2／0培养上清图2抗mCRP抗体效价的检测Figure2Thedetectionofanti-mCRPMcAbsM12170000100000700005500040000350002500015000M：分子量标准；1、2为纯化后的mCRP抗体（样品经过还原，上样量为30μg／孔）。图1SDS-PAGE检测纯化的mCRP抗体Figure1SDS-PAGEanalysisofpurifiedanti-mCRPMcAb·34·
ne-wayANOVA）比较各组间均数差异，P≤0．05为差异有统计学意义。2结果2．1杂交瘤细胞株的建立细胞融合后经HAT培养液筛选以及间接ELISA检测，取上清效价最高的细胞株采用有限稀释法单克隆化3次。杂交瘤细胞株经培养14周后仍能稳定分泌单克隆抗体，且经液氮冻存、复苏后，此细胞株仍能稳定分泌特异性抗mCRP抗体。2．2单抗的纯化小鼠腹腔接种分泌mCRP单抗的杂交瘤细胞后共获得15ml腹水，采用ProteinG亲和层析法提取纯度较纯、活性较好的mCRP抗体，，进行SDS-PAGE（图1）。2．3单抗的鉴定抗体的效价测定结果见图2，表明所制备的mCRP抗体与mCRP蛋白有较好的亲和力。Westernblot结果显示所纯化的mCRP抗体能与mCRP蛋白特异性结合，在23000处出现目的条带，与mCRP蛋白的预期大小相符（图3）。2．52．01．51．00．50D（450nm）1∶10001∶25001∶100001∶50001∶200001∶40000稀释倍数纯化的mCRP抗体SP2／0培养上清图2抗mCRP抗体效价的检测Figure2Thedetectionofanti-mCRPMcAbsM12170000100000700005500040000350002500015000M：分子量标准；1、2为纯化后的mCRP抗体（样品经过还原，上样量为30μg／孔）。图1SDS-PAGE检测纯化的mCRP抗体Figure1SDS-PAGEanalysisofpurifiedanti-mCRPMcAb·34·
【作者单位】： 南京医科大学第一附属医院老年心血管科;江苏省盛泽医院心血管科;
【基金】：国家自然科学基金(30900602) 江苏省科技厅自然科学基金(BK2011382) 江苏省“六大人才高峰”(2011WSN-029)
【分类号】：R392-33
【图文】：
ne-wayANOVA）比较各组间均数差异，P≤0．05为差异有统计学意义。2结果2．1杂交瘤细胞株的建立细胞融合后经HAT培养液筛选以及间接ELISA检测，取上清效价最高的细胞株采用有限稀释法单克隆化3次。杂交瘤细胞株经培养14周后仍能稳定分泌单克隆抗体，且经液氮冻存、复苏后，此细胞株仍能稳定分泌特异性抗mCRP抗体。2．2单抗的纯化小鼠腹腔接种分泌mCRP单抗的杂交瘤细胞后共获得15ml腹水，采用ProteinG亲和层析法提取纯度较纯、活性较好的mCRP抗体，进行SDS-PAGE（图1）。2．3单抗的鉴定抗体的效价测定结果见图2，表明所制备的mCRP抗体与mCRP蛋白有较好的亲和力。Westernblot结果显示所纯化的mCRP抗体能与mCRP蛋白特异性结合，在23000处出现目的条带，与mCRP蛋白的预期大小相符（图3）。2．52．01．51．00．50D（450nm）1∶10001∶25001∶100001∶50001∶200001∶40000稀释倍数纯化的mCRP抗体SP2／0培养上清图2抗mCRP抗体效价的检测Figure2Thedetectionofanti-mCRPMcAbsM12170000100000700005500040000350002500015000M：分子量标准；1、2为纯化后的mCRP抗体（样品经过还原，上样量为30μg／孔）。图1SDS-PAGE检测纯化的mCRP抗体Figure1SDS-PAGEanalysisofpurifiedanti-mCRPMcAb·34·
ne-wayANOVA）比较各组间均数差异，P≤0．05为差异有统计学意义。2结果2．1杂交瘤细胞株的建立细胞融合后经HAT培养液筛选以及间接ELISA检测，取上清效价最高的细胞株采用有限稀释法单克隆化3次。杂交瘤细胞株经培养14周后仍能稳定分泌单克隆抗体，且经液氮冻存、复苏后，此细胞株仍能稳定分泌特异性抗mCRP抗体。2．2单抗的纯化小鼠腹腔接种分泌mCRP单抗的杂交瘤细胞后共获得15ml腹水，采用ProteinG亲和层析法提取纯度较纯、活性较好的mCRP抗体，，进行SDS-PAGE（图1）。2．3单抗的鉴定抗体的效价测定结果见图2，表明所制备的mCRP抗体与mCRP蛋白有较好的亲和力。Westernblot结果显示所纯化的mCRP抗体能与mCRP蛋白特异性结合，在23000处出现目的条带，与mCRP蛋白的预期大小相符（图3）。2．52．01．51．00．50D（450nm）1∶10001∶25001∶100001∶50001∶200001∶40000稀释倍数纯化的mCRP抗体SP2／0培养上清图2抗mCRP抗体效价的检测Figure2Thedetectionofanti-mCRPMcAbsM12170000100000700005500040000350002500015000M：分子量标准；1、2为纯化后的mCRP抗体（样品经过还原，上样量为30μg／孔）。图1SDS-PAGE检测纯化的mCRP抗体Figure1SDS-PAGEanalysisofpurifiedanti-mCRPMcAb·34·
【作者单位】： 南京医科大学第一附属医院老年心血管科;江苏省盛泽医院心血管科;
【基金】：国家自然科学基金(30900602) 江苏省科技厅自然科学基金(BK2011382) 江苏省“六大人才高峰”(2011WSN-029)
【分类号】：R392-33
【参考文献】
相关期刊论文 前1条
1 刘剑南;陈相健;戴健;马继政;杨笛;张寄南;;C-反应蛋白对体外培养乳鼠心肌细胞的影响[J];中国临床康复;2006年21期
【共引文献】
相关期刊论文 前3条
1 古江勇;袁谷;朱永宏;徐筱杰;;芪参益气滴丸治疗心血管疾病的计算药理学研究[J];中国科学(B辑:化学);2009年11期
2 刘强;张丹丹;徐晋Y
本文编号：2541132
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