【摘要】：研究背景及目的意义器官移植可以挽救重要器官衰竭患者的生命,而目前移植术后发生的免疫排斥仍然是影响移植器官存活的最主要因素。利用多种策略诱导移植物产生免疫耐受,避免排斥,是移植免疫领域研究的最重要目标。研究结果表明,T淋巴细胞作为移植排斥反应的主要效应细胞,是影响移植物存活的关键细胞。因此针对T细胞介导的同种排斥机制的研究,有望在诱导长期移植耐受方面取得重要进展。自噬是一种存在于真核细胞的,应对压力的自稳调节机制。同种移植排斥反应是一种强烈的刺激信号,机体的自噬机制必然对这一过程产生多层次多方面精细调节,从而使移植受体保持内环境的稳定平衡。新近研究报道,自噬可从多个方面参与T细胞功能调节,影响T细胞的激活和存活,影响细胞因子的分泌。自噬可通过调控Treg细胞数量及活性影响移植排斥。雷帕霉素(Rapamycin,RAPA)是一种目前临床常用的免疫抑制剂,可抑制T细胞增殖,调节多种细胞因子的分泌水平,调节免疫应答,诱导机体产生移植免疫耐受。在多种不同疾病模型中,雷帕霉素可刺激产生不同种类的细胞因子,发挥多种多样的免疫调节效应。雷帕霉素还可诱导自噬激活。细胞因子是调节细胞活化,分化及效应的重要分子,可影响移植耐受的诱导。在自噬激活的状态下,同种移植排斥是否发生了变化,细胞因子分泌谱是否改变,最终是否影响同种移植物的存活,这些问题目前尚不清楚。3MA已作为自噬抑制剂用于多种模型的研究。在雷帕霉素作用下,使用3MA抑制自噬,能否影响雷帕霉素的免疫抑制效果,其分子机理如何,这些问题都有待进一步阐明。近期研究表明,Toll样受体5(TLR5)的激活剂鞭毛蛋白能延长同种异体移植物的生存,增加Treg细胞的数量。雷帕霉素诱导的同种移植耐受模型中,TLR5高表达。由于雷帕霉素在诱导耐受同时也增加了移植物自噬,自噬是否影响TLR5靶向同种移植排斥显像,对于TLR5靶向显像监测移植排斥具有重要意义。本论文通过两个部分,研究了雷帕霉素作用下同种移植物的生存状况以及自噬对同种移植耐受的影响和机理。一是研究自噬激活剂雷帕霉素及自噬抑制剂3MA对同种移植物的生存状况及机体免疫效应细胞的影响,对移植受体自噬分子表达的影响及调节。二是利用小鼠皮肤同种移植模型,研究自噬抑制剂体内处理后,移植排斥部位TLR5靶向的放射性核素显像是否受到影响。第一部分自噬调节对同种移植耐受的影响及分子机理研究方法1.同种皮肤移植模型建立:按照常规方法建立同种移植急性排斥小鼠模型,并随机分为四组:对照组、雷帕霉素组、3MA组和联合组;不同组分别进行雷帕霉素和/或3MA处理。2.雷帕霉素作用下同种移植皮片细胞因子测定:分离移植后第4天和第12天模型小鼠的移植皮片,RT-PCR检测细胞因子水平。3.自噬分子表达分析:分离移植后第4、12天的对照组和雷帕霉素组受体鼠脾CD4+和CD8+T细胞,进行Western Blot分析,检测自噬分子表达。分离移植后第12天对照组和雷帕霉素组受体鼠CD4+T细胞,用3MA体外处理8h,Western Blot检测自噬分子表达。分离第12天模型小鼠脾CD4+及CD8+T细胞,然后进行RT-PCR,检测细胞自噬分子表达。4.排斥期细胞因子检测:RT-PCR检测移植后第12天的四组模型小鼠脾CD4+T细胞的细胞因子。收集不同处理组模型小鼠血清,ELISA测定IL-10和IFN-γ的水平。5.Treg细胞分析:移植后第12天四组模型小鼠的脾CD4+T细胞被分离后,进行RT-PCR分析,检测Foxp3和TGF-β表达水平。提取移植后第12天模型小鼠脾细胞,流式细胞术分析Treg比例。6.细胞增殖分析:分离野生型BALB/c小鼠脾细胞,与C57B/6小鼠进行混合淋巴细胞培养,分别检测雷帕霉素和/或3MA处理之后效应淋巴细胞增殖状况。7.移植物生存期研究:移植后第7天开始逐日观察并记录模型小鼠同种移植皮片生存状况。研究结果1.移植物细胞因子表达状况:移植后第4天皮肤同种移植物Th1型(IL-2,IFN-γ)、Th2型(IL-4,IL-10)、Th17型(IL-17a)细胞因子表达水平均低于移植后第12天。移植后第12天,雷帕霉素组的同种皮肤移植物显示低Th1型(IL-2,IFN-丫)、高Th2型(IL-4,IL-10)和Th17型(IL-17a)细胞因子表达及高TGF-β表达。2.自噬在同种移植耐受中表达及特点:移植后第4天及第12天4组模型小鼠中,各组自噬分子Beclin1与LC3Ⅱ/Ⅰ表达趋势一致。在CD4+T细胞中,移植后第4天及第12天的雷帕霉素组这两种分子表达均明显高于对照组,而CD8+T细胞中,仅移植后第12天时的雷帕霉素组中,这两种分子表达高于对照组。在体外实验中,雷帕霉素处理组的CD4+T细胞的自噬较未处理的对照组显著增高,但增加3MA处理后,可使雷帕霉素组升高的自噬降低。体内实验中,雷帕霉素组CD4+T细胞ATG5表达比未处理对照组增高,但联合组的CD4+T细胞ATG5表达比雷帕霉素单独使用时低。体内实验中,CD8+T细胞ATG5的表达及雷帕霉素和3MA的影响与CD4+T细胞类似。3.CD4+T细胞及血清细胞因子的表达:移植后12天,与未处理的对照组相比,雷帕霉素组受体脾CD4+T细胞IL-4、IL-10(Th2型细胞因子)升高,IFN-γ(Th1型细胞因子)降低。雷帕霉素组小鼠血清中,IL-10升高,IFN-γγ降低。与单独雷帕霉素组相比,雷帕霉素与3MA联合组受体脾CD4+T细胞的IL-4、IL-10以及血清IL-10明显降低。4.调节性T细胞及相关因子表达:移植后12天,与未处理的对照组相比,CD4+T细胞中,雷帕霉素组Foxp3和TGF-β均升高。受体脾细胞中,雷帕霉素组CD25+Foxp3+Treg细胞均高于对照组。3MA使用后,Foxp3的表达和Treg的比例低于雷帕霉素组。5.细胞增殖结果:MLR结果显示,3MA和雷帕霉素单独或联合使用可以抑制效应细胞的增殖。联合组的细胞增殖较雷帕霉素单独使用时升高。6.移植物生存状况:与对照组相比,雷帕霉素体内注射可显著延长同种移植皮片的生存,而3MA单独使用未明显延长同种移植物的生存。联合组与雷帕霉素的生存期无明显差异,但是同种移植皮片状态良好。第二部分自噬调节对125I-anti-TLR5同种移植排斥靶向显像的影响研究方法1.放射性核素探针制备及鉴定:Iodogen法制备125I-anti-TLR5。进行标记率、放化纯和体外稳定性分析。2.体外特异性结合能力分析:分离BALB/c小鼠脾脏,制备单个细胞悬液,进行雷帕霉素和3MA处理,然后分析125I-anti-TLR5与细胞的结合及解离趋势。3.同种皮肤移植模型建立:建立小鼠同种皮肤移植模型,随机分为对照组、雷帕霉素组、3MA组和联合组四组,分别进行雷帕霉素和/或3MA处理。4.体内生物学分布研究:移植后第9天,对模型小鼠尾静脉注射125I-anti-TLR5,72h后处死,进行生物学分布测定,计算靶非靶比值(T/NT ratio)。5.动态全身磷屏放射自显影显像:移植后第9天,模型小鼠注射125I-anti-TLR5,于注射后24h、48h、72h进行磷屏全身自显影显像,观察移植皮片放射性浓聚状况。6.移植皮片病理学及免疫组化分析:分离移植后第12天的移植皮片,甲醛固定,石蜡包埋,制备切片,HE染色及Beclin1和TLR5免疫组化染色。研究结果1.125I-anti-TLR5的标记率及稳定性:成功制备125I-anti-TLR5,标记物的放化纯为95.88%,稳定性好,72h稳定性仍保持在90%以上。2.标记细胞结合及解离状况:与对照组相比,125I-anti-TLR5的结合与解离在雷帕霉素组、3MA组及联合组无明显差异。3.生物学分布研究:结果表明,各组模型小鼠的125I-anti-TLR5都是经肝代谢和肾排泄,移植皮片处放射性计数最高。雷帕霉素组(13.25)的T/NT比值明显高于对照组(4.32)及联合组(6.46)。4.动态磷屏放射自显影显像:注射标记物后48h,雷帕霉素及联合组的移植皮片显像清楚。48h和72h时,图像放射性活度比值分析表明:雷帕霉素组(2.52,5.33)及联合组(2.22,2.46),比对照组(1.30,1.46)显著升高。在72h时雷帕霉素组(5.33)比联合组比值(2.46)明显升高。5.HE及免疫组化染色结果分析:移植皮片病理学HE染色表明,与雷帕霉素组和联合组相比,对照组和3MA组炎性浸润明显;联合组与雷帕霉素单独组相比,二者类似,均无明显炎性浸润。免疫组化染色结果表明,Beclin1与TLR5表达趋势一致。与3MA组相比,对照组及雷帕霉素组Beclin1与TLR5表达增高,而联合组无明显变化。全文总结1.同种皮肤移植急性排斥期Th1细胞因子的分泌显著高于移植早期非特异性炎症期。自噬激活剂雷帕霉素体内应用可诱导同种移植物低Th1型、高Th2和Th17型细胞因子表达。2.自噬参与调节雷帕霉素诱导的耐受。抑制自噬对雷帕霉素诱导耐受无明显影响;自噬可促进雷帕霉素诱导的Th2型细胞因子优势、Treg细胞高比例和Foxp3高表达促进同种耐受。3.雷帕霉素作用下,自噬抑制对TLR5靶向的放射性核素标记分子探针监测同种移植排斥无明显影响。125I-anti-TLR5可用于免疫耐受状态下同种移植排斥显像。本文研究结果为阐明自噬对同种移植排斥影响提供了理论基础,为TLR5靶向特异性监测同种移植物排斥提供了实验依据,具有重要意义。创新点1.自噬激活剂雷帕霉素体内应用可诱导同种移植物细胞因子谱改变,表达低Th1型、高Th2和Th17型细胞因子。2.自噬参与调节雷帕霉素诱导的耐受,抑制自噬对雷帕霉素诱导的免疫耐受无明显影响;自噬可促进雷帕霉素诱导的Th2型细胞因子优势、Treg细胞高比例和Foxp3高表达促进同种耐受。3.自噬抑制对雷帕霉素作用下的TLR5靶向的放射性核素标记分子探针对同种移植排斥监测无明显影响。125I-anti-TLR5可用于免疫耐受状态下同种移植排斥显像。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R392
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本文编号：
2541578
