基于质谱技术对免疫球蛋白N-糖基化定量分析方法建立与应用

发布时间：2020-02-24 20:53

【摘要】：继核酸和蛋白质组学研究之后,人类又发现了承载着生物信息的大分子——聚糖,它被称作是“DNA-mRNA-蛋白质”遗传信息流的延续。在生命体内,蛋白质糖基化作为翻译后修饰的一部分,在生命过程中发挥了非常重要的作用,因此对聚糖的研究吸引了人们的目光。但是由于糖链结构非常复杂而且它不是由基因直接翻译表达的产物,因此对糖生物功能的系统分析困难重重,为了解决这一难题,科学家们提出糖组学这一全新研究理论。在糖组学研究中,人们试图通过对机体内糖链、糖蛋白等进行研究以阐明基因功能及细胞功能。研究表明,蛋白糖基化现象与肿瘤的形成与发展有一定相关性,因此分析蛋白糖基化修饰对于研究肿瘤的机制及临床诊断治疗意义重大,这极大地推动了肿瘤早期诊断技术的进步。本课题在加州大学戴维斯分校Lebrilla B.Carlito课题组完成,采用该课题组创建的糖蛋白定量测定方法,即采用超高效液相色谱联合三重四级杆质谱(UPLC-QqQMS/MS)对生物血清中免疫球蛋白IgG、IgA和IgM上的糖蛋白进行定量测定。该方法与之前常用的糖链定量方法相比,具有以下优点:(1)减少了分析样品的取样量。由于糖链在整个蛋白中所占比例极低,而且糖链在质谱中的响应较差,极易受到其他物质的干扰,因此传统方法中对糖链进行分析时,需要加大样品取样量。而在本方法中我们是对N-糖肽进行分析,即对糖链及其连接的肽段进行同时测定,从而大大增加了待测物在整个样品中所占比例,而且N-糖肽在质谱中响应较好。在该方法中,样品取样量由传统的50μL减少到2μL,大大缩减了取样量,降低了基质等对样品测定时信号响应的干扰,更重要的是减少了取样对机体造成的损伤;(2)前处理方法节约成本,操作简便,重现性好。由于该方法是对糖蛋白进行定量,因此不需要PNGase F等糖苷酶进行糖链释放等前处理,从而缩减了研究成本,省略了糖链提取所需要的固相萃取、上清液挥干等复杂且费时的操作步骤,在简化操作的同时,克服了由于PNGase F酶切不完全导致糖链定量重现性低等缺点;(3)同时得到糖基化位点与糖蛋白信息。由于传统的糖链分析是将糖链从糖蛋白上释放出来,丢失了糖链所连接的糖蛋白与糖基化位点信息,仅仅对同类的糖链进行定量。新定量方法提供了对蛋白的绝对定量及带有蛋白位点信息糖基化谱,这为判断糖谱的变化是由蛋白糖基化引起还是由蛋白浓度变化引起提供了重要的依据,增加分析结果的可信度。对同一肽段连接的相同糖链以及不同肽段连接的相同糖链进行比较,通过细化的分类,使可能存在的具有统计学差异的糖蛋白更容易被发现。经实验验证,该方法操作简便、结果稳定可靠、重现性好,为寻找疾病中糖蛋白相关的生物分子标志物提供了重要的方法支持。在本课题研究中,我们采用以上建立的n-糖肽定量新方法,对胃癌n-糖肽生物分子标志物进行研究。在本研究中,我们选用两组生物样品(两组生物样品均含有胃炎患者血清与胃癌患者血清),首先对两组生物样品同时进行分析测定,通过对第一组数据进行t-检验分析,得到胃炎患者血清与胃癌患者血清中igg、iga和igm上具有显著性差异的蛋白与n-糖肽,作为潜在的胃癌生物标志物;然后将以上发现的潜在生物标志物应用于第二组样品分析中,采用rlanguage进行最小二乘法(partialleastsquares,pls)分析,观察潜在的生物标志物能否将胃炎与胃癌两组病人分开。分析结果表明,通过对约60种不同的糖蛋白进行统计分析,找到7个具有显著性差异的糖蛋白,通过应用这7种糖蛋白对测试组进行pls分析,结果表明,胃炎患者与胃癌患者之间已出现一定的分离趋势。在本研究中,我们不仅仅对胃癌血清免疫球蛋白n-糖肽分子生物标志物进行分析,同时对目前治疗癌症具有广阔发展前景的的生物药物重组单克隆抗体(recombinantmonoclonalantibody,rmab)进行了n-糖基化研究。重组单克隆抗体药物作为一种有效治疗癌症和慢性疾病的生物药物一经上市就受到高度重视。该类药物具有分子靶向性,其抗癌机理如下:(1)能够激活人体自身免疫系统杀死肿瘤细胞;(2)阻断肿瘤细胞的信号转导,改变细胞基因表达,从而抑制或杀死肿瘤细胞;(3)能够携带放射性抗肿瘤药物靶向性地抵达肿瘤细胞,从而杀死肿瘤细胞。目前,已有30多种重组单克隆抗体经fda批准进入市场,同时有上百种候选药物正在进行临床实验。由此可见,该类药物在抗肿瘤等慢性疾病治疗上表现出色,具有很大发展空间,这也吸引了众多药企对rmabs药物的开发与生产。到目前为止,所有经批准的rmabs药物都属于免疫球蛋白igg,但是igg的四个亚型igg1、igg2、igg3和igg4都具有不同的药效,因此根据疾病来选择igg亚型给药对于该类药物的使用至关重要。同时,有研究表明,该类药物的n-糖基化直接影响到药物特性,甚至影响到该类药物与细胞结合、激活等作用,而且rmabs作为生物药物,其批间与批内稳定性非常关键。因此对igg亚型的快速鉴定以及对药物中n-糖链的种类与n-糖基化位点定量测定是rmabs药物在研发与生产过程的关键步骤。在这类药物快速发展的背景下,建立对其进行n-糖基化谱与n-糖基化位点相关的定量分析高通量方法成为亟待解决的问题。在本课题研究中,我们采用uplc-qqq-ms/ms建立了对rmabs药物中n-糖肽进行定量的高通量分析方法。在该方法中,省略了蛋白的富集与n-糖链释放等步骤,对n-糖肽直接分析,建立了rmabs药物的n-糖肽谱,并且通过mrm质谱分析方法对药物中的n-糖肽进行快速测定。方法验证结果表明,该方法操作简便、快速、可靠、重现性好。在该方法基础上,我们对六种已上市的rMAbs药物的N-糖肽进行定量分析,结果表明,虽然构成药物的IgG亚型不同,但是各亚型中包含的主要糖链及其含量基本一致。进一步地,我们建立了rMAbs药物N-糖基化位点定量分析方法。当使用PNGase F酶切N-糖链后,与该糖链相连的肽段中的Asn(114.043Da)残基转变为Asp残基(115.027Da),分子量增加0.984Da,从而可以通过测定这种分子量上的变化对肽段进行定量分析。本研究根据这一特性,对rMAbs药物中的糖链采用PNGase F进行酶解,对残留的肽段进行MRM质谱分析,通过对肽段标准品进行线性回归,得到药物中N-糖基化与未糖基化的肽段的绝对质量。在本课题中,我们对六种rMAbs中N-糖基化位点进行定量测定,实验结果表明,不论药物属于何种IgG亚型,N-糖基化的糖蛋白在97%以上,说明rMAbs药物中绝大多数N-糖基化位点都被N-糖链所占据。本课题建立了快速、高效、准确、可靠的N-糖肽定量分析MRM方法,主要对胃癌与目前有效的抗癌药物重组单克隆抗体的N-糖肽进行定量分析,为后续的疾病N-糖肽分子标志物的探索以及重组单克隆抗体药物的质量标准检测与新药研发提供了重要的方法依据。
【图文】：

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图 1-1 N-糖链、O-糖链结构与相应糖蛋白模型。（a）N-糖基化类型；（b）O-糖基化核心结构；（c）N-连接与 O-连接糖蛋白。三、蛋白糖基化研究的意义糖基化在生命机体中发挥了非常重要的作用，涉及到生理、病理等众多方面。在特定的状态下，糖蛋白量的变化和/或其糖链结构的改变，能够体现特定的生理、病理过程[7]。在免疫系统中起到关键作用的分子基本上都是糖蛋白，这类糖蛋白主要位于细胞膜表面，生物机体血清中免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）糖链的异常，可能会导致机体自身免疫性疾病，这类疾病包括类风湿关节炎、甲状腺炎、系统性红斑狼疮和艾滋病等[8]。在对癌细胞与肿瘤细胞的研究中发现，这些细胞表面的糖链会出现不同于正常细胞的状态，例如他们的糖链会发生唾液酸化、β-1，6-N-乙酰葡糖胺化、岩藻糖化等糖链结构的变化。研究结果表明，细胞中糖链结构的异常变化、糖链数量的改变以及糖基化情况的变化普遍存在于肿瘤的发生、发展过程中，如膜糖蛋白在细胞外

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图 1-2 ESI 电喷雾电离原理ESI 源通常是由带有高电压的电喷雾毛细管、电喷雾毛细管与连通高真空区的孔之间的电位差还有一些去溶剂装置组成。图 1-2 所示为正离子条件下的 ESI 。电喷雾尖端的电场（Ec）与电喷雾针的尺寸和所加电压(Vc)成一定比例关系：Ec= ln(4 ) 公式中 rc是喷针的半径，，d 是喷针与反转电极之间的距离。2、常用质谱检测器（1）四级杆质谱四级杆质谱广泛应用于各个领域，一般采用单四级杆或三重四级杆作为质量分工具，也可以作为离子传输装置来选择离子。与飞行时间质谱（TOF）和傅立叶
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R392

【参考文献】