压力—应激大鼠模型的建立及心肌损伤机制研究

发布时间：2020-03-18 12:33

【摘要】：研究目的:本研究从压力-应激的角度出发,建立压力-应激大鼠模型,旨在通过组织形态学观察、尿液儿茶酚胺代谢产物水平测定和心肌细胞能量代谢产物检测的方法,就长期压力-应激刺激对大鼠心肌组织产生损伤的机制进行探讨。研究方法:1.动物模型的建立:将60只雄性SD大鼠根据体重和旷场试验评分随机分为正常对照组(2周组、4周组和6周组)和应激模型组(2周组、4周组和6周组),每组10只,对照组正常饲养,模型组给予不可预测性复合应激结合孤养建立压力-应激大鼠模型。2.行为学评价:通过旷场试验和蔗糖水消耗试验结果来评定大鼠造模前后的行为学变化情况,作为压力-应激大鼠模型是否建立成功的依据。3.心肌组织形态学观察:造模结束后,麻醉大鼠并对左心室取材制作石蜡切片,进行HE染色和Masson染色,观察心肌组织形态学变化。4.检测Cx43蛋白表达水平:采用免疫组织化学法检测大鼠心室肌组织Cx43蛋白表达水平。5.儿茶酚胺代谢产物含量测定:收集大鼠24 h尿液,用ELISA检测试剂盒测定儿茶酚胺代谢产物香草扁桃酸(VMA)的含量。6.采用匀浆、差速离心法分离心肌组织线粒体,分别测定心肌组织细胞浆和线粒体细胞色素C含量。研究结果:1.行为学评价:与对照组相比,从应激造模第4周起,模型组大鼠蔗糖水偏爱率显著降低,差异具有统计学意义(P0.01),旷场试验中水平活动评分、垂直活动评分均显著降低,粪便粒数增加,差异具有统计学意义(P0.001)。2.组织形态学观察:在光镜下,从应激造模第4周起,模型组大鼠组织HE染色可见心肌细胞排列紊乱,横纹消失,细胞间隙增大,部分肌纤维断裂、溶解,Masson染色可见心肌间质纤维化,胶原纤维增生且排列无序,并随着造模时间的延长纤维化程度加重。而对照组大鼠HE染色可见心肌细胞呈短柱状,排列整齐,结构清晰完整,部分可见横纹,形态及分布未见异常;Masson染色可见胶原纤维仅在心肌间质及血管周围少量分布。3.心肌组织Cx43蛋白表达水平:与对照组相比,模型组大鼠在应激早期(2周)时Cx43蛋白表达无明显变化;在应激中期(4周)时Cx43蛋白表达降低,但与同期对照组相比差异无统计学意义(平均光密度值分别为0.0211±0.0062vs 0.0259±0.0038,P0.05);在应激后期(6周)时可见Cx43蛋白表达明显降低,与同期对照组相比差异具有统计学意义(平均光密度值分别为0.0110±0.0028 vs 0.0268±0.0025,P0.001)。4.儿茶酚胺代谢产物测定结果:在应激早期(2周),模型组大鼠香草扁桃酸(VMA)浓度显著高于对照组,且差异具有统计学意义(P0.001)。在应激中期(4周)和后期(6周),这种差异持续存在且具有统计学意义(P0.001)。5.细胞浆、线粒体Cyt-C测定结果:在应激早期(2周),与对照组相比,模型组大鼠心肌组织细胞浆和线粒体Cyt-C均无显著性差异(P0.05)。在应激中期(4周),模型组大鼠心肌组织细胞浆Cyt-C浓度稍有升高,但与同期对照组相比,差异无统计学意义(P0.05);线粒体Cyt-C浓度与同期对照组相比,无显著差异(P0.05)。在应激后期(6周),模型组大鼠心肌组织细胞浆Cyt-C含量显著升高,与同期对照组相比,差异具有统计学意义(P0.001);线粒体Cyt-C含量显著降低,与同期对照组相比,差异具有统计学意义(P0.001)。研究结论:1.压力-应激可引起大鼠行为学特征改变,出现愉快感缺失、兴趣减退、抑郁焦虑等情感变化,采用不可预测性复合应激建立的大鼠模型可以作为压力-应激相关性疾病研究的实验动物模型。2.压力-应激可引起体内交感神经过度激活,导致心肌细胞氧化呼吸链能量代谢异常,引起心肌形态学异常改变,以及心律失常相关蛋白异常表达,可能与猝死的发生相关。
【图文】：

示意图,标准品,示意图,标记物

图 2-1 VMA 标准品的配制示意图（4）洗涤工作液的配制：将浓洗涤液按 1:25 倍用去离子水进行稀释。具作：用量筒量取 240 mL 去离子水倒入干净烧杯中，再量取 10 mL 浓洗涤液上述含去离子水的烧杯中，充分搅拌混匀。（5）HRP 标记物工作液的配制：HRP 标记物工作液按 1:100 倍用 HRP 标稀释液进行稀释。吸取 10 μL HRP 标记物加入到 990 μL HRP 标记物稀释液轻吹打混匀。HRP 标记物工作液于临用前 10 min 配制。（6）操作步骤：①加样：按实验所需在酶标板上设计好空白孔、标准品孔和待测样品孔。往标准品孔和待测样品孔中加入 50 μL 标准品或待测样本，并立即加入 HR记物工作液 50 μL，在实验台上轻轻晃动酶标板以助混匀，然后盖上板贴放7℃温浴箱中温浴 60 min。空白孔不加上述液体。②洗板：温浴 60 min 后用力甩干孔内液体，每孔加入 200 μL 洗涤液，浸 min 后洗板。洗板时在实验台上垫数层吸水纸包住酶标板，用力朝下拍打数

变化情况图,变化情况,大鼠,行为指标

图 3-1 实验期间大鼠体重变化情况注：***表示与对照组比较，，P＜0.001场试验结果评定激前，两组大鼠在旷场试验中各项行为指标的比较均无显著差从第 2 周开始，模型组大鼠水平活动评分显著减低（t=-3.568，P =数显著增多（t=9.091，P＜0.001），这种差异自此之后一直存在，意义。而垂直活动评分在第 4 周开始模型组大鼠较对照组大鼠显.575，P＜0.001），并一直存在于整个实验过程中。造模期间两组行为学差异结果见表 3-2、表 3-3、表 3-4、图 3-2A、图 3-2B、图表 3-2 应激 2 周后大鼠旷场试验行为结果组间比较（ x ±s，n=10）组别水平活动评分垂直活动评分粪便颗粒模型组 27.30 ± 11.71**12.10 ± 2.96 4.10 ± 0.74
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R54;R-332

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