E3泛素连接酶WAZX2通过泛素化TBK1正向调节其介导的抗病毒作用

发布时间：2020-03-18 22:13

【摘要】：目的第一部分:TBK1是干扰素β产生以及抗病毒天然免疫反应的关键蛋白。TBK1的修饰会影响抗病毒天然免疫反应。明确WAZX2泛素连接酶对于TBK1的泛素化修饰作用,并且探究WAZX2在抗病毒天然免疫反应中的调控作用。第二部分:塞泽里综合征是一种具有抗凋亡能力的皮肤T细胞淋巴瘤。最近研究发现转录因子SATB1在塞泽里综合征中对抗凋亡的重要性。课题组前期研究发现在某些条件下SNF5是SATB1的上游调节蛋白,并且二者在塞泽里综合征细胞中都低表达。明确SNF5和SATB1在塞泽里综合征中对其抗凋亡能力产生的影响。因此,设计SWI/SNF复合物为靶点的药物可能会成为治疗塞泽里综合征的一个新思路。方法第一部分:1.通过带有GFP荧光的VSV-Δ51病毒对HEK293T细胞进行感染,倒置显微镜观察以及流式细胞术检测被感染HEK293T细胞GFP发光情况。2.通过仙台病毒SeV感染HEK293T细胞,提取细胞的RNA,反转录为cDNA后,Real-time PCR检测IFN-βmRNA水平情况。同时荧光素酶报告基因实验检测IFN-β启动子活性。3.用LPS刺激或VSV病毒感染iBMDM细胞,分别在4h、8h和12h收取细胞并提取RNA,检测WAZX2 mRNA水平情况。4.通过荧光报告基因实验检测RIG-I N、MAVS、TBK1、IKKi、IRF3 5D等接头蛋白激活的信号后,WAZX2对IFN-β启动子活性的影响。同时,通过免疫共沉淀技术检测WAZX2和接头蛋白的相互作用。5.采用免疫共沉淀方法检测WAZX2对TBK1泛素化水平修饰的改变以及泛素化修饰的类型。第二部分:1.通过基因芯片分析,研究SNF5表达缺失,对SATB1表达的影响。2.利用qRT-PCR和Western Blot的方法验证SNF5缺失表达的小鼠胚胎成纤维细胞、胸腺细胞、T细胞以及淋巴瘤细胞中SATB1的表达情况。3.将SNF5过表达载体转染于293T细胞中,或者在T细胞淋巴瘤细胞系中通过免疫共沉淀技术检测相互作用。4.采用qRT-PCR技术检测SATB1在SNF5低表达的塞泽里综合征细胞中的表达情况;同时,在塞泽里综合征细胞中恢复SATB1、SNF5的表达,或者恢复SNF5表达的同时抑制SATB1的表达,利用流式细胞术检测细胞的凋亡情况;Western Blot的方法观察Caspase信号通路中相关蛋白的表达水平。结果第一部分:1.荧光显微镜下发现带有GFP荧光的293T细胞,在过表达WAZX2的情况下比对照组减少;并且流式细胞术检测带有GFP荧光的HEK293T细胞也减少。利用siRNA抑制HEK293T细胞中WAZX2的表达,则结果相反。2.SeV感染WAZX2过表达的HEK293T细胞后,IFN-βmRNA表达水平升高,并且荧光素酶报告基因实验发现IFN-β的启动子活性增强;siRNA抑制293T细胞中WAZX2表达后,结果相反。3.LPS刺激或VSV病毒感染iBMDM细胞后,wazx2 mRNA表达水平上升高。4.在RIG-I N、MDA5、MAVS、TBK1所激活的信号通路中,WAZX2对IFN-β的启动子活性都具有上调作用,但是对IKKi和IRF3 5D所引起的IFN-β的启动子活性无明显改变;WAZX2缺失表达后结果相反。免疫共沉淀技术发现外源的TBK1与外源的WAZX2存在相互作用。5.WAZX2使TBK1泛素化水平增加;WAZX2表达缺失后,结果相反。WAZX2增加了TBK1 K63位形式的泛素化。第二部分:1.基因芯片分析发现,在SNF5表达缺失情况下,SATB1表达会下降。2.qRT-PCR和Western Blot的方法验证发现SNF5缺失表达的小鼠胚胎成纤维细胞、胸腺细胞、T细胞以及淋巴瘤细胞中SATB1的表达会随之下调。3.通过比对人和酵母中SNF5和SATB1氨基酸序列,发现人的SNF5与酵母中的序列相似度达到36%,而人的SATB1与酵母中的序列相似度达到26%;进一步通过免疫共沉淀技术发现在Hut78和HEK293T细胞系中SATB1与SNF5存在相互作用。4.在SNF5缺失的小鼠CD8~+T细胞淋巴瘤细胞以及Hut78细胞中,SATB1在RNA水平呈现低表达;在Hut78细胞中恢复SATB1、SNF5的表达,发现细胞抗凋亡能力减弱,被切割的Caspase8和Caspase3蛋白水平升高;当恢复SNF5表达的同时抑制SATB1的表达,发现细胞的抗凋亡能力无明显变化,被切割的Caspase8和Caspase3蛋白水平有所减少。结论第一部分:1.WAZX2对于HEK293T细胞的抗病毒能力起到了正向调控作用。2.WAZX2正向调控IFN-βmRNA水平表达,并且正向调控IFN-β信号通路。3.巨噬细胞系中,在LPS的刺激下或者是VSV病毒的感染下会影响正向调节wazx2 mRNA水平的表达。4.在RIG-I N、MAVS、TBK1、IRF3 5D所激活的信号通路中,WAZX2对IFN-β启动子活性都具有正向调控的作用;并且发现细胞中外源的WAZX2与TBK1存在相互作用。可见,TBK1很可能是WAZX2的靶分子。5.外源WAZX2使外源TBK1的泛素化增加,并且增加的是K63位形式的泛素化修饰。WAZX2可能是通过对TBK1增加K63位形式的泛素化,增强了TBK1的功能,最终正向调控了抗病毒天然免疫反应。第二部分:1.在一些类型的细胞中,SWI/SNF复合物直接调节了SATB1的表达。2.在一些类型的细胞中,SNF5表达缺失导致SATB1的低表达。3.SATB1特异地与SNF5(或SWI/SNF复合物)相互作用。4.在塞泽里综合征中,SNF5低表达可引起SATB1表达下调,最终导致该疾病具有抗凋亡的能力。
【图文】：

模式图,抗病毒蛋白,信号级联,模式图

3图 1，TLR，RLR 和 NLR 抗病毒蛋白信号级联放大的模式图（JEM，2016 Vol.213, No.1）素对天然免疫信号通路调控白翻译后修饰（PTMs）形成了精细的调节天然免疫信号通路的一修饰是其中关键的一种修饰。泛素化就是将一个 8.6KD 大小的泛接。泛素化修饰主要是发生在泛素的七个赖氨酸 11/K27/K29/K33/K48/K63），从而形成赖氨酸连接的多聚泛素链； N 末端的蛋氨酸形成线性多聚泛素链。另外，泛素链可能会被去（DUBs）。如图 2 所示，泛素由 UBB 和 UBC 基因编码，是一个蛋白。泛素连接到靶蛋白的过程分为三步。病毒感染机体后可以3 来调节泛素修饰的靶位点，也可以通过劫持宿主的 E3 使其功能

泛素,作用机制,病毒,泛素化

泛素修饰系统对抗病毒作用机制（JEM，，2016 Vol.213, No.1）LRs 激活的信号通路中， RIG-I 的 CARDs 结构域发生 K63 位的多后会发生四聚化。泛素化修饰导致 RIG-I 在线粒体处发生积累，-CARD 与 MAVS 的相互作用。第一个发现的病毒感染引起的 RI位点是 K172，依靠 TRIM25 增加了这一位点的泛素化修饰[29]。TIG-I的CARDs结构域中除了K172以外的另外两个残基：K154和K报道，这三个残基被 RNF135 引起泛素化修饰[31]。USP3 通过移去链来抑制IFN-β的产生[32, 33]。在许多病毒感染中MAVS都作为了靶5 使 MAVS 上第 7 位和第 10 位的赖氨酸泛素化修饰，导致 MAVS酶水解[34]。线粒体膜上结合的 E3 蛋白 MARCH5 通过将 MAVS 第位赖氨酸多聚泛素化修饰，有效地分解了 MAVS 的聚合并使 MANF5 促进了 MAVS 第 362 位和第 461 位赖氨酸的多聚泛素化，然71 位和第 420 位赖氨酸被 AIP4 多聚泛素化修饰[36-38]。cIAP1 这个
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R392

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